Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos
Summary
Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.
Abstract
A formação de ligações funcionais em uma rede neuronal em desenvolvimento seja influenciado por sinais extrínsecos. O crescimento de neurite de neurônios em desenvolvimento está sujeita a sinais químicos e mecânicos, e os mecanismos pelos quais ele sente e responde a sinais mecânicos são mal compreendidos. A elucidação do papel das forças na maturação das células irá permitir a concepção de andaimes que pode promover a adesão celular e o acoplamento do citoesqueleto ao substrato, e, por conseguinte, melhorar a capacidade de diferentes tipos neuronais para regenerar após uma lesão.
Aqui, nós descrevemos um método para aplicar medidas de espectroscopia de força simultâneos durante a laser lesão celular induzida. Medimos liberar a tensão no axônio parcialmente lesada por rastreamento interferométrico simultânea de uma sonda ótica preso aderido à membrana do axônio. Nosso protocolo experimental detecta a liberar a tensão com a sensibilidade piconewton, ea dinâmica da liberação de tensão noresolução de tempo de milissegundos. Por isso, oferece um método de alta resolução para estudar como o acoplamento mecânico entre as células e os substratos podem ser moduladas por tratamento farmacológico e / ou propriedades mecânicas distintas do substracto.
Introduction
A microscopia óptica é um dos sistema de imagiologia menos invasivas disponíveis para observar as células vivas. Com a exploração de efeitos, tais como pressão de radiação (como pinças ópticas 1), ou fluxo de fótons de alta energia (como a laser dissecador 2), esta tecnologia foi estendida para nano-manipulação. O sistema de imageamento óptico fornece um controle preciso para visualizar e manipular alvos celulares sub 3. Ao mesmo tempo, graças à calibração precisa da potência do laser emitido, instrumentos ópticos de realizar qualquer manipulação da amostra mole ou invasiva, com reprodutibilidade precedentes.
Vários laboratórios integrados, na mesma configuração experimental, pinças ópticas e dissecador laser para ablação organelas 4, para se fundem células diferentes 5, ou para estimular as células de cargas opticamente impulsionado 6,7. Enquanto as pinças ópticas, depois da calibração da rigidez óptico, para permitiro controlo da força aplicada à célula numa escala piconewton, sistemas laser de dissecação pode modular manipulação óptica, que varia de membrana de formação de poros para foto-ablação de organelos individuais ou dissecação das estruturas sub-celulares. No entanto, a calibração de dissecção de laser baseia-se na avaliação qualitativa da entidade de manipulação óptica no que diz respeito à energia entregue à amostra, com base, principalmente, na análise de imagem que ilustra as alterações morfológicas causados à amostra 8. No método apresentado, é mostrado como para executar a medição de espectroscopia de força durante a dissecção axonal de laser de um neurónio em desenvolvimento, para quantificar, na escala piconewton, a força produzida por uma alteração do equilíbrio da estrutura de citoesqueleto um compartimento subcelular 9. Neurónios cultivados aderir ao substrato e, durante o desenvolvimento polarizar. A fase de polarização ocorre durante os primeiros cinco dias in vitro. Na fase dois de polarização, um dos EXTRUDing neurites se torna mais longo, e que irá diferenciar para se tornar o axónio 10. Alongamento axonal em resposta a uma força de tracção no cone de crescimento tem sido modelada pelo modelo de Dennerl 11. Recentemente, este modelo tem sido alargado para 12 incluem o papel da adesão de neurites para os substratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, proposto após as observações experimentais 13, mostrou que as forças de puxar no cone de crescimento, propagação ao longo da neurite, são modulados por adesões focais ao substrato. Da mesma forma, a lesão axonal produz uma liberação local de tensão propagando em direção ao corpo celular. Assim, propôs que a medição tal tensão lançado em um local ao longo do axônio entre a lesão ea soma celular oferece a possibilidade de avaliar o resultado de amortecimento de adesões focais não afetadas.
Nós calibrar a energia necessária fotões fluxo do dissector laser para controlar a extensão da DAMAG axonal infligidae, a partir de transecção completa a lesão parcial. Após a calibração, repetiu-se a lesão parcial dos axónios de vários neurónios diferenciados e o protocolo desenvolvido para quantificar a libertação da tensão, e assim obtido um parâmetro quantitativo para estimar a aderência do axónio para o substrato 14.
No presente trabalho, nós descrevemos em pormenor o protocolo desenvolvido, o que representa um procedimento experimental preciso para avaliar e comparar com sensibilidade piconewton axonal a adesão ao substrato, em condições experimentais diferentes, tais como o tratamento de substâncias químicas 14, ou diferentes tipos de suporte de cultura celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos neste trabalho um método quantitativo para comparar a adesão neurite ao substrato da cultura, através da realização de medidas de espectroscopia de força simultânea durante a laser lesão celular induzida. A libertação da tensão medida está relacionada com o grau de adesão das células ao substrato: as células com maior número de adesões focais devem libertar menos tensão. Medição da libertação da tensão em termos de piconewtons fornece uma grandeza física pelo qual se avalia a aderên…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani para o desenvolvimento do sistema de controle em tempo real, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima para discussões criteriosas, Giacomo PRUZZO e Alessandro Parodi para o desenvolvimento de produtos eletrônicos personalizados e softwares, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni para seu aconselhamento e assistência na preparação de cultura de células.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
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