레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는
Summary
우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.
Abstract
개발 신경 네트워크 기능 연결의 형성은 외부의 신호에 의해 영향을 받는다. 개발 신경 세포의 신경 돌기 성장은 화학적 및 기계적 신호에 따라, 그리고 메커니즘을하는 기계적인 신호는 감지 및 응답을 제대로 이해하고 있습니다. 세포의 성숙에 힘의 역할을 해명하는 것은 기판에 세포 부착 및 세포 구조 커플 링을 홍보 할 수있는 발판의 디자인을 활성화하고 따라서 부상 후 재생하는 다른 신경 세포 유형의 능력을 향상시킬 것입니다.
여기, 우리는 레이저에 의한 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 적용하는 방법을 설명합니다. 우리는 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브의 동시 간섭 추적에 의해 부분적으로 lesioned 축삭의 긴장 방출을 측정합니다. 우리의 실험 프로토콜은 piconewton 감도와 긴장의 방출을 감지하고의 긴장 릴리스의 동적밀리 초 시간 해상도. 따라서 세포와 기질 사이의 기계적인 결합이 약물 치료 및 / 또는 기판의 독특한 기계적 특성에 의해 조절 될 수있는 방법을 연구하는 고해상도 방법을 제공합니다.
Introduction
광학 현미경은 살아있는 세포를 관찰 할 수있는보다 적게 침략 이미징 시스템 중 하나입니다. 이러한 방사 압력 (광학 핀셋 1에서와 같이), 또는 고 에너지 광자 플럭스 (레이저 해부 2 등) 등의 효과의 착취,이 기술은 나노 조작으로 확장되었다. 광학 이미징 시스템은 3을 시각화하고 하위 표적 세포를 조작하는 정밀한 제어를 비치한다. 동시에, 전달 된 레이저 출력의 정확한 교정 덕분에, 광학 도구는 전례없는 재현성도 부드럽거나 침입 샘플 조작을 수행.
여러 실험실 다른 세포는 5 융합하거나, 광학적으로 구동화물 6,7에 의해 세포를 자극하는 세포 소기관 4, 브레이션하기 위해 동일한 실험 장치, 광학 핀셋 및 레이저 해부에 통합됩니다. 광 핀셋, 광 강도의 보정 후를 허용하면서piconewton 규모의 셀에 적용되는 힘의 제어, 레이저 박리 시스템은 막 사진 poration에서 하위 세포 구조의 단일 세포 기관 또는 박리 절제 범위는 광학 조작, 조절 할 수 있습니다. 그러나 레이저 해부 교정은 주로 시편 8 인한 형태 학적 변화를 설명하는 이미지 분석을 기반으로 샘플 공급 에너지에 대하여 광학 조작의 실체의 질적 평가에 의존합니다. 제시된 방법으로, 우리는 piconewton 규모에, 정량화, 개발 신경 세포의 레이저 축삭 해부 동안 힘 분광 측정을 수행하는 방법을 보여줍니다, 하위 세포 구획 9 골격 구조에서 변경된 평형에 의해 생성되는 힘. 교양 뉴런은 기판에 부착하고, 개발 과정에서 극성. 편광 단계는 체외에서 처음 다섯 일 동안 발생합니다. 단계에서 편광의 두 extrud 중 하나ING의 신경 돌기는 오래되어, 축삭 10되기 위해 차별화됩니다. 성장 원뿔 견인 힘 님의 질문에 답변 축삭 신장은 이전 Dennerl의 모델 (11)에 의해 모델링되었습니다. 최근이 모델은 세포 외 기질 기판 돌기 접착의 역할을 포함하는 12 확장되었습니다. 실험 관찰 13 후 제안이 생물 물리학 모델은, 신경 돌기를 따라 전파, 성장 콘에 힘을 당기는 기판에 초점 유착에 의해 변조 것으로 나타났다. 마찬가지로, 축삭 병변은 세포체쪽으로 전파 긴장의 로컬 버전을 생성합니다. 따라서, 우리는 병변과 셀 소마 사이의 축삭을 따라 위치에 같은 발표 장력을 측정하는 것은 영향을받지 초점 유착 꺾는 결과를 평가할 수있는 가능성을 제공하는 제안했다.
우리는 잊어 버리고 축삭은 damag의 범위를 제어하는 데 필요한 에너지 레이저 해부학자의 광자 플럭스 보정E, 완전 절개에서 부분적인 병변. 교정 후, 우리는 몇 가지 차별화 된 뉴런의 축색 돌기에 부분적으로 병변을 반복 장력 릴리스를 계량 프로토콜을 개발하고, 따라서 기판 (14)에 축삭의 접착력을 측정하는 정량적 매개 변수를 얻을.
본 연구에서, 우리는 세부에서 이러한 화학적 처리 14, 또는 세포 배양 지원의 다른 유형과 같은 다른 실험 조건에서 기판에 축삭 접착력을 평가하고 piconewton 감도와 비교하는 정확한 실험 절차를 나타냅니다 개발 된 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는이 연구에서 레이저 유도 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 수행하여 문화 기판에 돌기 접착력을 비교하는 정량 방법을보고합니다. 긴장의 측정 자료는 기판 세포의 부착 정도와 관련되어 초점 유착의 높은 숫자를 가진 세포는 덜 긴장을 해제해야합니다. piconewtons의 측면에서 긴장의 방출을 측정하는 것은 서로 다른 실험 조건 14 문화 지원에 축삭 접착력을 평가하는 물리적 인 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실시간 제어 시스템, 통찰력 토론, 자코모 Pruzzo와 알레산드로 PARODI 사용자 정의 전자 제품과 소프트웨어의 개발, 그리고 클라우디아 Chiabrera과 전문가의 조언 및 세포 배양 준비에 도움 마리나 Nanni에 대한 에벨 리나 Chieregatti와 하나코 쓰시마 개발을위한 알베르토 Guiggiani.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
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