Måling av spenningen slipper Under Laser Induced Axon Lesion å evaluere aksonal feste til overflaten på Piconewton og Millisekund Oppløsning
Summary
Vi målte spenningen utgivelsen i en axon som ble delvis lesioned med en laser dissector ved samtidig kraft spektroskopi måling utført på en optisk fanget probe overholdt membran av axon. Den utviklet eksperimentelle protokollen vurderer axon vedheft til kultur underlaget.
Abstract
Dannelsen av funksjonelle forbindelser i et u neuronal nettverk er påvirket av ytre signaler. Den neurite veksten i utviklingsland nevroner er underlagt kjemiske og mekaniske signaler, og de mekanismer som det sanser og reagerer på mekaniske signaler er dårlig forstått. Belyse hvilken rolle krefter i celle modning vil gjøre utformingen av stillas som kan fremme celle vedheft og cytoskeletal kobling til underlaget, og dermed forbedre kapasiteten på ulike nevrale typer å regenerere etter skade.
Her beskriver vi en metode for å søke samtidige kraft spektroskopi målinger under laser indusert celle lesjon. Vi måler spenning utgivelse i delvis lesioned axon ved samtidig interferometrisk sporing av en optisk fanget probe overholdt membran av axon. Vår eksperimentelle protokollen oppdager spenningen utgivelsen med piconewton følsomhet, og den dynamiske av spenningen ble utløst vedmillisekund tidsoppløsning. Derfor gir det en høy oppløsning metode for å studere hvordan den mekaniske koplingen mellom cellene og substrater kan bli modulert ved farmakologisk behandling og / eller ved forskjellige mekaniske egenskaper av substratet.
Introduction
Optisk mikroskopi er en av de mindre invasiv avbildning system tilgjengelig for å observere levende celler. Med utnyttelse av effekter som stråling trykket (som optisk pinsett 1), eller høy-energi foton flux (som i laser dissector 2), ble denne teknologien utvidet til nano-manipulasjon. Den optiske imaging system møblerer en presis kontroll for å visualisere og manipulere sub mobilnettet mål tre. Samtidig, takket være nøyaktig kalibrering av den leverte laser makt, optiske verktøy oppnå enten myke eller invasiv prøve manipulasjon med enestående reproduserbarhet.
Flere laboratorier integrert, i den samme eksperimentelle oppsettet, optiske pinsetter og laser dissector for å avsmelte organeller 4, for å smelte sammen forskjellige celler 5, eller for å stimulere cellene av optisk drevet last 6,7. Mens optiske pinsett, etter kalibrering av den optiske stivhet, tillatekontroll av anvendt kraft til cellen på en piconewton skala, kan laser disseksjon systemer modulerer optisk manipulasjon, som spenner fra membran foto-poration til ablasjon av single organeller eller disseksjon av sub-cellulære strukturer. Men stoler laser disseksjon kalibrering på en kvalitativ vurdering av foretakets av optisk manipulasjon med hensyn til energien som leveres til prøven, hovedsakelig basert på bildeanalyse illustrerer morfologiske forandringer forårsaket i prøven 8.. I presenterte metoden, viser vi hvordan du utfører kraft spektroskopi måling under laser axonal disseksjon av et utviklingsland nervecellen, å kvantifisere, på piconewton skala, styrken produsert av en endret likevekt i cytoskeleton strukturen i en sub-mobilnettet kupé ni. Dyrkede nerveceller holder seg til underlaget, og polarisere under utvikling. Polariseringen fasen oppstår i løpet av de første fem dagene i vitro. På trinn to av polarisering, en av extruding neurites blir lengre, og det vil differensiere til å bli den axon 10. Aksonal forlengelse som reaksjon på tauekraft på veksten kjegle har tidligere blitt modellert ved Dennerl modell 11.. Nylig har denne modellen blitt utvidet 12 til å omfatte rollen som neurite vedheft til de ekstracellulære matrix underlag. Dette biophysical modell, foreslo etter eksperimentelle observasjonene 13, viste at å trekke styrkene på vekst kjegle, som forplanter seg langs neurite, er modulert av fokale sammenvoksninger til underlaget. Likeledes produserer aksonal lesjon en lokal frigjøring av spenning som forplanter seg mot cellens legeme. Således foreslo vi at måle slik frigjøres strekket i en posisjon langs axon mellom lesjon og cellen soma gir muligheten til å vurdere den dempende utfallet av upåvirkede fokal adhesjon.
Vi kalibrerer den nødvendige energien fotonet-flux av laser dissector å kontrollere omfanget av påført aksonal SKADERe, fra komplett transection til delvis lesjon. Etter kalibrering, gjentok vi delvis lesjon til axons av flere differensierende nevroner og utviklet protokollen for å kvantifisere avspenning, og dermed fått en kvantitativ parameter å anslå vedheft av axon til underlaget 14.
I dette arbeidet, beskriver vi i detalj utviklet protokoll, som representerer en presis eksperimentell prosedyre for å evaluere og sammenligne med piconewton følsomhet nerveskaden heft til underlaget i ulike eksperimentelle forhold som kjemisk behandling 14, eller ulike typer cellekultur støtte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer i dette arbeidet en kvantitativ metode for å sammenligne den neurite adhesjon til kultur-substrat, ved å utføre simultan kraft spektroskopi måling under laser-indusert celle lesjon. Den målte frigjøring av spenning er relatert til graden av adhesjon av cellen til substratet: celler med et større antall kontaktpunkter adhesjon bør frigi mindre spenning. Ved å måle frigjøring av spenninger i form av piconewtons gir en fysisk kvantitet som å evaluere den axonal hefting til kulturen støtten i for…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani for utvikling av sanntids kontrollsystem, Evelina Chieregatti og Hanako Tsushima for innsiktsfulle diskusjoner, Giacomo Pruzzo og Alessandro Parodi for utvikling av tilpassede elektronikk og programvare, og Claudia Chiabrera og Marina Nanni for sine ekspertråd og hjelp i cellekultur forberedelse.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
