Summary
زرع الخلايا يمثل استراتيجية لعلاج انحطاط الشبكية تتميز بفقدان مستقبلات ضوئية. هنا نصف طريقة لإثراء المستقبلات الضوئية القابلة للزراعة وتطعيمها تحت الشبكية في الفئران البالغة.
Abstract
ويمثل ضعف البصر والعمى الناجم عن فقدان خلايا استشعار الضوء في شبكية العين، أي المستقبلات الضوئية، السبب الرئيسي للإعاقة في البلدان الصناعية. يمثل استبدال المستقبلات الضوئية المتحللة عن طريق زرع الخلايا خيارا علاجيا محتملا في التطبيقات السريرية المستقبلية. في الواقع، أظهرت الدراسات السابقة السريرية الحديثة أن المستقبلات الضوئية غير الناضجة، المعزولة عن شبكية عين فأرة حديثي الولادة في اليوم الرابع بعد الولادة، لديها القدرة على الاندماج في شبكية العين الماوس الكبار بعد زرع تحت الشبكية. ولدت الخلايا المانحة مورفولوجيا مستقبلات ضوئية ناضجة بما في ذلك الأجزاء الداخلية والخارجية ، وجسم خلية مستديرة تقع في الطبقة النووية الخارجية ، ومحطات متشابكة على مقربة من الخلايا ثنائية القطب الذاتية. والواقع أن التقارير الأخيرة أظهرت أن المستقبلات الضوئية المانحة تندمج وظيفيا في الدوائر العصبية للفئران المضيفة. لتطبيق السريرية في المستقبل من هذا النهج استبدال الخلايا، تعليق تنقية الخلايا التي تختارها يجب أن تتولد ووضعها في الموضع الصحيح للاندماج السليم في العين. لإثراء سلائف المستقبلات الضوئية، ينبغي أن يستند الفرز إلى مستضدات سطح الخلية المحددة لتجنب التعديل الوراثي للمراسل للخلايا المانحة. هنا نعرض فرز الخلايا المرتبطة بالمغناطيسية (MACS) - إثراء سلائف مستقبلات ضوئية قضيب قابلة للزراعة معزولة عن شبكية العين الوليدية للفئران المراسلة الخاصة بالمصولجان الضوئي استنادا إلى علامة سطح الخلية CD73. الحضانة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD73 تليها الأجسام المضادة الثانوية المقترنة حبة صغيرة سمح لإثراء السلائف مستقبلات ضوئية قضيب من قبل MACS إلى ما يقرب من 90٪. بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي ، فإن MACS لديه ميزة أنه يمكن تطبيقه بسهولة على معايير GMP وأنه يمكن فرز كميات عالية من الخلايا في فترات زمنية قصيرة نسبيا. أدى حقن تعليق الخلايا المخصب في الفضاء تحت الشبكي للفئران البرية البالغة إلى ارتفاع معدل التكامل بمقدار 3 أضعاف مقارنة بتعليق الخلايا غير المفحذ.
Introduction
الرؤية هي واحدة من الحواس الرئيسية للبشر. ويشكل ضعف هذا الشعور والعمى أحد الأسباب الرئيسية للإعاقة في البلدان الصناعية. السبب الرئيسي لضعف البصر أو العمى هو انحطاط الشبكية ، الذي يتميز بفقدان الخلايا المستقبلة ضوئيا ، حيث يمكن ملاحظته في الضمور البقعي ، والتهاب الشبكية الصباغي ، وضمور المخروط القضيب ، وغيرها من الحالات. حتى الآن، لا يتوفر علاج فعال لاستعادة الرؤية المفقودة. في 2006 و 2008 ذكرت مختبرين مختلفين, مستقلة عن بعضها البعض, زرع ناجحة من الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية قضيب في شبكية العين الفئران البرية الكبار1,2. وهكذا، تنشأ إمكانية زرع الخلايا السليفة مستقبلات ضوئية أيضا في شبكية العين المنحطة، لتحل محل مستقبلات ضوئية منحطة واستعادة الرؤية. في الواقع، وقد ثبت مؤخرا، أن مثل هذه الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية زرع تثير معايير مورفولوجية من مستقبلات ضوئية ناضجة من النوع البري، مثل الأجزاء الخارجية المتقدمة بشكل صحيح3،المحطات متشابك على مقربة من الخلايا ثنائية القطب الذاتية وجسم الخلية المستديرة الموجودة في الطبقة النوويةالخارجية 2-4،فضلا عن القدرة على الاندماج وظيفيا في الدوائر العصبيةالمضيفة 5-7. أحد المبادئ الرئيسية لهذه الاستراتيجية هو استخدام الشبكية الفئران الصغيرة بعد الولادة اليوم 4 (PN 4، PN0 كما يوم الولادة)، مما أدى إلى خليط من أنواع مختلفة من الخلايا لزرع. على خلفية تطبيق علاجي في المستقبل ، يجب تنقية هذا الخليط لخلايا السلائف المستقبلة. وقد وصفت CD73 كأول علامة سطح الخلية محددة لتصورات ضوئية الشباب في شبكية العين8-10. هنا، ونحن نثبت طريقة تنقية الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية على أساس هذه العلامة سطح الخلية ومع استخدام تقنية فرز الخلايا المرتبطة المغناطيسية (MACS). قد يكون ل MACS مزايا بالمقارنة مع تقنيات فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، نظرا لأوقات الفرز السريعة والتكيف الأسهل مع ظروف GMP. يمكننا أن نظهر إثراء ~ 90٪ ومعدل تكامل أعلى يصل إلى 3 أضعاف عند زرع السكان المخصبين في الفضاء تحت الشبكية في شبكية العين البرية الكبار. وهكذا، فإن المستقبل الضوئي القائم على MACS إثراء الخلايا السليفة وزرع تحت الشبكية، هي تقنيات موثوقة وواعدة لتطوير استراتيجية علاجية تجديدية لعلاج انحطاط الشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الاستخدام الأخلاقي ورعاية الحيوانات:
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقوانين الأوروبية والألمانية (Tierschutzgesetz) وتم الالتزام ببيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة دريسدن و Landesdirektion Dresden (رقم الموافقة: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. قبل بدء تفكك الخلية وفرز الخلايا
- تسمية ثلاثة أنابيب رد فعل 15 مل مع: غسل (W)، كسر إيجابي (+) وكسر سلبي (-).
2. انفصال الشبكية
- قطع رأس الجراء PN 4 باستخدام مقص.
- شطف رأس الجراء قريبا في الإيثانول 70٪ تليها الغسيل في برنامج تلفزيوني.
- نقل الرأس إلى HBSS الباردة وتنجيل العين (كرر هذه الخطوة لجميع رؤساء). ل enucleate، افتح الجفون وركز العين مع ملقط منحني في منطقة العصب البصري. ثم سحب العين بعناية من المدار.
- بعد تجميل جميع العيون، قم بعزل الشبكية: أدخل مقصا مغلقا إلى العصب البصري وافتح الشفرات. بيل وRPE / chorid بها. إزالة العدسات والأوعية الدموية باستخدام ملقط منحني.
- نقل شبكية العين المعزولة إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل تحتوي على محلول papain (التي تقدمها عدة فك فصيلة papain).
- احتضان شبكية العين في محلول papain لمدة 30-60 دقيقة في حمام مائي أو شاكر (400 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية.
- في حين أن شبكية العين تحتضن في محلول الباباين ، ماصة 1 مل من محلول أوفوموكويد إلى أنبوب تفاعل 15 مل (التسمية "1").
- إضافة 60 ميكرولتر من DNase I (10 ملغ / مل) + 60 ميكرولتر من محلول أوفوموكويد (التي تقدمها عدة) + 520 ميكرولتر من EBSS إلى أنبوب رد فعل 15 مل (التسمية "2").
- بعد حضانة الباباين، نقل محلول papain التي تحتوي على شبكية العين هضمها جزئيا إلى أنبوب رد الفعل "2".
- باستخدام ماصة مصقول النار، وإجراء التفكك الميكانيكية (10x صعودا وهبوطا).
- ماصة تعليق خلية واحدة إلى أنبوب رد فعل "1". في محاولة لتوليد 2 طبقات بطبقات بلطف تعليق الخلية على رأس الحل ovomucoid.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق بسرعة 300 × غرام (حوالي 1300 دورة في الدقيقة).
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
3. فرز الخلايا باستخدام المغناطيسية المرتبطة فرز الخلايا (MACS)
- إضافة X ميكرولتر الجرذ المضادة CD73 الأجسام المضادة ل500 ميكرولتر من أجل تحقيق تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- احتضان 5 دقائق على الجليد.
- ملء أنبوب رد الفعل 15 مل إلى 10 مل مع MACS العازلة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق بسرعة 300 × ز.
- أزل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه في 480 ميكرولتر MACS العازلة وإضافة 120 ميكروغرام من الميكروبات IgG الماعز المضادة للفئران.
- احتضان 15 دقيقة على الجليد; لا تحرض، يهز أو مزجها.
- ملء أنبوب رد الفعل 15 مل إلى 5 مل مع MACS العازلة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- كما تم طرد أنبوب رد الفعل:
- ضبط عمود LS في الحامل المغناطيسي.
- وضع عامل تصفية preseparation أعلى العمود LS.
- هيدرات مرشح preseparation والعمود LS مع 3 مل MACS العازلة وجمع المخزن المؤقت MACS في أنبوب غسل (W).
- أزل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه في 500 ميكرولتر MACS العازلة.
- قم بتحميل تعليق الخلية 500 ميكرولتر إلى الفلتر، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت MACS إلى الفلتر واجمع الكسر السالب في أنبوب التفاعل السالب (-).
- بعد ذلك، أضف 3 × 3 مل من المخزن المؤقت MACS إلى العمود لغسل الخلايا غير المرتبطة بالعمود
- مرة واحدة هذه 9 مل هي من خلال العمود LS، وإزالة العمود من موقف المغناطيسي وتثبيته على رأس أنبوب رد فعل الكسر الإيجابي (+).
- تحميل بسرعة 5 مل من المخزن المؤقت MACS في العمود LS ووضع المكبس في العمود LS واضغط عليه حتى المخزن المؤقت بأكمله من خلال العمود.
- الطرد المركزي أنبوب رد الفعل الذي يحتوي على كسر إيجابي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- إزالة supernatant، resuspend في 500 ميكرولتر من العازلة MACS والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية.
- عد إجمالي عدد الخلايا باستخدام جهاز عد الخلايا الشائعة.
- إعداد تعليق الخلية من كسر مفروز موجب يحتوي على 2 × 105 خلايا / ميكرول في المخزن المؤقت MACS والاحتفاظ عند 4 درجة مئوية
4. زرع MAC فرزها الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس
- تأكد من أن يكون كل من الحلول التالية جاهزة: 1 مل برنامج تلفزيوني معقم أو HBSS، 10 ميكرولتر DNAse I، 1-2 مل deionized عقيمة H2O، aliquots من كسور تعليق الخلية في 4 درجة مئوية.
- تخدير الماوس الكبار(أي 2-4 أشهر من العمر) مع حقن داخل الصفاق من هيدروكلوريد ميدتوميدين (0.01 ملغ/10 غرام وزن الجسم), الكيتامين (0.75 ملغ/10 غرام وزن الجسم). ثم القيام بحقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ وزن الجسم) لتخفيف الألم.
- توسيع التلاميذ مع انخفاض فينيليفرين 2.5٪ تروبيكميد 0.5٪.
- إصلاح الماوس في حامل رأس الماوس ومكان تحت المجهر ستيريو.
- تطبيق قطرة من هلام Visidic لمنع تجفيف العين.
- جعل ثقب صغير على الحدود بين تصلب القرنية (على التوالي أورا سيراتا)باستخدام عقيمة 30 G 1/2 في إبرة.
- قطع غطاء الشريحة المشتركة إلى قطع صغيرة (حوالي 5 ملم × 5 ملم) باستخدام قلم الماس، ووضع واحدة من هذه القطع على رأس القرنية، مما يسمح التصور المباشر للشبكية.
- قم بغسل حقنة الميكرويتر المفروقة عدة مرات بالماء المتأين.
- تحميل حقنة ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من تعليق الخلية، إبرة مباشرة عرضيا من خلال الملتحمة والشد ووضع تحت السيطرة البصرية في النصف الأنفي من شبكية العين.
- لكمة بلطف ثقب في شبكية العين حتى الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية، وحقن تعليق الخلية في الفضاء تحت الشبكية.
- مراقبة انفصال الثيران من شبكية العين، والتي ينبغي أن تكون موحدة، وتغطي ما يقرب من 1/4 من مساحة الشبكية دون أي نزيف.
- سحب الحقنة بلطف، ثقب الشبكية الأختام تلقائيا.
- اغسل حقنة الميكرويتر عدة مرات بالماء المتأين.
- تحرير الماوس من حامل الرأس.
- استيقظ الماوس عن طريق حقن هيدروكلوريد atipamozole لعكس تأثير هيدروكلوريد ميدتوميدين.
- ضع الماوس لوقت الاستيقاظ في غرفة مظلمة دافئة (حوالي 25 درجة مئوية).
- في اليومين التاليين بعد الزرع ، يجب إعطاء البوبرينورفين (0.05 ملغ / كجم من وزن الجسم) عن طريق الحقن تحت الجلد في الصباح وبعد الظهر لتخفيف الألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل تقييم قدرة مستقبلات ضوئية قضيب على الاندماج في شبكية العين الماوس، تم استخدام خط مراسل الماوس، الذي هو مدفوع GFP من قبل سستة لووسين الشبكية العصبية (Nrl، Nrl-GFP) المروج11. Nrl هو أقرب علامة على مستقبلات ضوئية قضيب بدء التعبير في E12.5 طوال مرحلة البلوغ، مما يسمح وضع علامات محددة من الخلايا مستقبلات ضوئية قضيب المانحة.
تم قطع رأس الجراء PN 4 Nrl-GFP وتم تلقيح العينين. ثم تم عزل شبكية العين وانشقاقها باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه. ثم تم فرز تعليق الخلية الناتجة باستخدام MACS المستندة إلى CD73(الشكلين 1 و 2). بعد فرز MAC، قمنا بتحليل الإثراء الذي تحقق أثناء هذا الإجراء.
كما هو مبين في الشكل 3A، يحتوي تعليق الخلية الأولي (الإدخال) على خلايا إيجابية GFP بنسبة 30.4٪ ، أي. مستقبلات ضوئية قضيب. بعد فرز MAC المستندة إلى CD73، لوحظ إثراء يصل إلى 86.9٪ في الكسر الإيجابي CD73 (CD73+) عن طريق قياس التدفق الخلوي. في كسر CD73-سالب (CD73-) فقط 9.9٪ من جميع الخلايا تم الكشف عنها بشكل إيجابي لGFP(الشكل 3A). إثراء الخلايا الإيجابية NRL-GFP بعد MACS CD73 مقرها هو تصور بالإضافة إلى ذلك بعد الطلاء في المختبر (الشكل 3B).
بعد فرز MAC، تم نسج الخلايا المانحة في الكسر الإيجابي CD73 وإعادة إنفاقها إلى تركيز نهائي قدره 200،000 خلية / ميكرولتر. وقد استخدم هذا التعليق الخلية كذلك لزرع في الفضاء تحت الشبكية من نوع البرية المضيف(الشكل 4). بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من زرع الأعضاء، تم إصلاح شبكية العين المضيفة وعزلها وتقسمها. دمجت عدة خلايا مانحة في الطبقة النووية الخارجية للمضيفين واكتسبت مورفولوجيا المستقبلات الضوئية الناضجة مع توطين جسم الخلية في الطبقة النووية الخارجية وتشكيل كروات متشابكة وشرائح داخلية(الشكل 5). وقد نشرت صور مفصلة من قبل مجموعتنا3,8 تظهر نتيجة مماثلة مع الخلايا التي تم فرزها FAC زرعها لاستضافة شبكية العين من قبل مجموعات أخرى4,6,10. متسقة في كل هذه الدراسات هو, أن الخلايا المزروعة البقاء في موقع الحقن, التي تحددها شبكية العين المضيفة منفصلة الثور, ولا تهاجر بعيدا. بعض الاندماج في شبكية العين المضيفة(أي الطبقة النووية الخارجية)، والبعض الآخر لا تزال في الفضاء تحت الشبكية3. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين، أن توزيع الخلايا المانحة في موقع التكامل يعتمد على نوع من نموذج الماوس المستخدمة5. لم يتم الكشف عن أي علامات رفض المضيف / الكسب غير المشروع الحادة في عمليات زرع بين الفئران C57BL/6J.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 المخطط العام لزرع تحت الشبكية من MACS تنقية السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس الكبار. يتم عزل الخلايا المانحة من الجراء PN 4 Nrl-GFP ، تليها عملية فرز MAC المستندة إلى CD73 وزرعها في الفضاء تحت الشبكية المضيفة للفأرة. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم إثراء المستقبلات الضوئية القابلة للزراعة بواسطة MACS. يتم احتضان تعليق الخلية المتولدة من جميع شبكية العين PN4 التي تم جمعها مع الأجسام المضادة الأولية المضادة للCD73 الفئران تليها الغسيل والحضانة مع الأجسام المضادة للفئران المقترنة الميكروبات. الأجسام المضادة غير المقيدة يتم غسلها. يتم تمرير تعليق الخلية من خلال LS-العمود الذي يرتبط مع موقف المغناطيسي. تبقى الخلايا المرتبطة بالأجسام المضادة متصلة بالعمود بينما يتم تحرير الخلايا المتبقية وجمعها (كسر سالب CD73). وأخيرا، تتم إزالة LS-العمود من الحامل المغناطيسي ويتم eluted الخلايا المتبقية وجمعها (CD73-كسر إيجابي). انقر هنا لعرض الفيلم الكامل.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحليل إثراء الخلايا الإيجابية NRL-GFP بعد فرز MAC المستندة إلى CD73. قبلالفرز، كان السكان الأوليون للخلايا المانحة يحتويون على 30.4٪ من الخلايا الإيجابية NRL-GFP. بعد فرز MAC، يمكن الكشف عن إثراء الخلايا الإيجابية ل GFP في كسر CD73+ (86.9٪) في حين أن الكسر CD73- يحتوي على كميات منخفضة فقط من خلايا GFP + (9.9٪). (ب) صورة تمثيلية توضح نتيجة فرز MAC المستندة إلى CD73 لخلايا PN4 Nrl-GFP. 1 مليون خلية من كل جزء كانت مطلية على أغطية مغلفة بالنعناع. تم إصلاح الخلايا 4 ساعات بعد الطلاء مع 4٪ PFA لمدة 10 دقائق. كانت الخلايا ملطخة DAPI (4'،6-diamidino-2-phenylindole، 1:20،000). لوحظ إثراء كبير للخلايا الإيجابية ل GFP في كسر CD73+ عند مقارنتها بكسر الإدخال أو كسر CD73. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال حقن تحت الشبكية. رسم تخطيطي لعملية الزرع في شبكية العين الماوس الكبار. يتم إدخال الإبرة من خلال ثقب في أورا سيراتا، انتقل من خلال الفضاء الزجاجي عن طريق تجنب لمس العدسة ووضعها في شبكية العين تحت السيطرة البصرية. عن طريق دفع لطيف، يتم لكم الإبرة من خلال شبكية العين ووضعها في الفضاء تحت الشبكية. في نهاية المطاف، يتم حقن تعليق الخلية بعناية تحت السيطرة البصرية عن طريق تقييم عملية الانفصال.
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم دمج خلايا المستقبل الضوئي المزروعة. صورة تمثيلية تصور أجهزة MACS المدمجة المستندة إلى CD73 فرز خلايا PN4 Nrl-GFP بعد زرعها في شبكية العين الماوس الكبار. تتكامل سلائف المستقبل الضوئي المزروعة بشكل صحيح في الطبقة النووية الخارجية (ONL) وتولد مورفولوجيا مستقبلات ضوئية ناضجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زرع تحت الشبكية من الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية يمثل أداة موثوقة لتحقيق دمج هذه الخلايا الحساسة للضوء في شبكية العين المضيفة بأعداد كبيرة1,2. وهذا قد يسمح بإنشاء العلاج الخلوي لعلاج أمراض الشبكية التنكسية في المستقبل6. السكان المانحة من الخلايا، معزولة حاليا من شبكية العين PN 4، هو خليط من أنواع الخلايا المختلفة، والتي فقط الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية تتكامل بعد الحقن تحت الشبكية. باستخدام CD73 القائم على لجنة الهدنة العسكرية الفرز، يمكن زيادة نسبة مستقبلات ضوئية داخل تعليق الخلية المانحة إلى ≈ 90٪ التي تسمح بمعدل تكامل أعلى بنحو 3 أضعاف في شبكية العين المضيفة البرية من نوع بالمقارنة مع عدد الخلايا غير مفروز8. بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي ، فإن MACS تتمتع بميزة إجراء الفرز السريع وأنه يمكن تطبيقه بسهولة نسبية على معايير GMP. تنقية مستقبلات ضوئية قابلة للزراعة هي ذات أهمية خاصة في ضوء المزايا الأخيرة للجيل المختبري من المستقبلات الضوئية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات12-14. تتكون ثقافات الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المختلفة من أنواع خلايا متنوعة مما يجعل توافر إجراءات فرز محددة شرطا أساسيا لاستخدامها في المستقبل في علاجات زرع الخلايا.
ووفقا لإجراء تنقية نظام MACS، هناك عدة نقاط جديرة بالملاحظة، مما يضمن سير العمل دون اضطرابات كبيرة. كلما زاد عدد الشبكية التي سيتم فرزها ، كلما زادت الحاجة إلى وقت للهضم. بعد الهضم ، أثناء إجراء الفرز ، يجب تجنب تجميع الخلايا. هذا يحدث ويفضل قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية وخلال حضانة لها. في هذه الحالة، يجب إزالة التجميع فورا مع ماصة. أثناء elution من المخزن المؤقت MACS أثناء جمع كسر MACS-السلبية، فمن الضروري للغاية عدم إضافة أكثر من 3 مل إلى العمود. ضغط المخزن المؤقت إلى العمود سيكون مرتفعا جدا إذا تمت إضافة أكثر من 3 مل المخزن المؤقت. وهذا سوف يزعج ربط الأجسام المضادة للخلايا ويقلل من كفاءة الفرز. عند إزالة العمود من الحامل المغناطيسي لبدء جمع الكسر الإيجابي ل MACS ، يجب القيام بهذه الخطوة بسرعة. يجب إضافة 5 مل من المخزن المؤقت MACS إلى العمود في أسرع وقت ممكن. أيضا، يجب وضع الهبوط والضغط عليه بسرعة حتى يتم المخزن المؤقت بأكمله من خلال العمود. ليس من الضروري أن تقلق بشأن الضغط المطبق. المخزن المؤقت MACS isotonic ويمكن أن تختلف. من الممكن استخدام المخزن المؤقت FACS أو وسيطة ثقافة الخلية أو PBS أو EBSS أو HBSS. يمكن تحقيق عقم العازلة عن طريق التصفية من خلال غشاء فلتر 0.4 ميكرومتر.
بعد التخصيب بواسطة MACS ، يمكن تحقيق زرع ناجح للخلايا المانحة إلى الفضاء تحت الشبكية عن طريق الاحتفاظ بالنقاط التالية في الاعتبار. منذ خلايا مستقبلات ضوئية ويبدو أن تكون حساسة جدا للعلاج السابقين في الجسم الحي، فإنه ليس من المستحسن أن تبقى على 4 °C أطول من اللازم. تابع عملية الزرع في أسرع وقت ممكن. عند إدخال إبرة الحقن في مقلة العين ، من المهم تجنب لمس العدسة لأن الإبرة المعدنية الحادة نسبيا قد تضر العدسة مما يؤدي إلى تحريض التهاب العنبية الناجم عن العدسة. الخطوة الأخيرة في الطريق إلى الفضاء تحت الشبكية ، واختراق شبكية العين ، أمر بالغ الأهمية. نظرا لأنه لا يمكن ملاحظة ما إذا كان يتم الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية من المهم تطوير شعور لليمين دفع الضغط ومقاومة الأنسجة. لاختبار, إذا تم وضع رأس إبرة بشكل صحيح, يمكن تطبيق حجم صغير وينبغي أن يلاحظ انفصال الشبكية في رأس إبرة بعناية. إذا كانت هناك جولة ، مفرزة الثور دون نزيف تتشكل ، فإن الوضع صحيح ويمكن تطبيق بقية الحل بعناية. أثناء الحقن، يجب أن تبقى الإبرة في موقفها لتجنب المزيد من الضرر للأنسجة. ثقب الشبكية التي أنشأتها إبرة الحقن سوف ختم من تلقاء نفسها إذا تم سحب الإبرة ببطء. يجب أن يتم الإجراء بأكمله في الحد الأدنى من الوقت الممكن لتجنب المزيد من الإجهاد والضرر للحيوان. أثناء الزرع ، يميل تعليق الخلية إلى تكتل ومنع حقنة الميكرويتر. إذا حدث هذا، يقترح تخفيف تعليق الخلية باستخدام برنامج تلفزيوني معقم أو HBSS. وهناك احتمال آخر للتغلب على هذه المشكلة هو إضافة 1 ميكرولتر من DNAse I إلى تعليق الخلية، لإذابة كتل الحمض النووي من الخلايا الميتة، والتي تميل إلى الغراء الخلايا الحية معا.
يقتصر هذا البروتوكول على الفرز المغناطيسي للخلايا. لذلك، يمكن فرز الخلايا لعلامة واحدة فقط لكل جولة الفرز. بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي ، حيث يمكن فرز الخلايا باستخدام علامات مختلفة (بما في ذلك الخصائص الفسيولوجية وكذلك علامات سطح الخلية المختلفة) في نفس الوقت ، وهذا هو عيب كبير من هذه التقنية. كلما كان هناك حاجة لفرز علامات مختلفة في نافذة زمنية قصيرة، قد يكون قياس التدفق الخلوي الحل الأفضل. أيضا، الفرز لخصائص الفلورسنت من الخلايا، مثل GFP أعرب عن وراثيا أو غيرها من علامات خلايا الحياة غير ممكن مع هذه التقنية. وهو يقتصر حاليا على استخدام الأجسام المضادة سطح الخلية التي يمكن أن تترافق مع الخرز المغناطيسي. ومع ذلك، يمكن توسيع نطاق هذه التقنية استنادا إلى المعدات التقنية المستخدمة.
منذ Miltenyi Biotec حاليا المزود الوحيد للخلايا المغناطيسية أدوات الفرز ، لا يوجد بديل متاح حتى الآن. فصلات الخلية، يمكن استخدام إنزيمات أخرى غير باباين(أي تريبسين). من الجدير بالذكر، حقق مختبرنا أفضل النتائج مع الباباين، لأن هذا يبدو أن إنزيم التفكك الأكثر لطفا في أيدينا. النافذة الزمنية لهضم الباباين (30-60 دقيقة) متغيرة. في هذه النافذة الزمنية تم تحقيق الهضم الأمثل في مختبرنا. قد يكون من الضروري توفير وقت حضانة أقصر أو أطول اعتمادا على حجم العينة وجودة العينة والإنزيم المستخدم. ويقترح إجراء اختبارات فردية.
وبالنظر إلى أن MACS أحادي الخطوة لا يصل إلى مستويات نقاء عالية مثل قياس التدفق الخلوي ، فقد يكون التطبيق الإضافي المحتمل لهذه التقنية هو الفرز السلبي للخلايا الضارة غير المرغوب فيها والمحتملة. هناك، يمكن فرز كسر الخلية الإيجابي لعلامة سطح الخلية معينة ولكن ليس من الفائدة، وترك جزء من الفائدة معزولة في التدفق من خلال. ويمكن القيام بذلك مقدما أو بعد خطوة فرز إيجابية ويسمح بمزيد من التمييز للخلايا باستخدام علامات سطح الخلية المختلفة وكذلك إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، مثل خلايا طبقة التغذية أو الخلايا غير المتمايزة من ثقافات الخلايا الجذعية متعددة القدرات مع مخاطرها السرطانية المحتملة. لذلك ، قد تكون MACS مناسبة لتنقية المستقبلات الضوئية من ثقافات خلايا ES أو iPS في التطبيقات العلاجية المستقبلية المحتملة لأنها تمثل علاجا لطيفا وسريعا وبسيطا لتنقية كميات عالية من الخلايا المستزرعة. يمكن تطبيق MACS بسهولة على شروط GMP نظرا لأن تفاصيل خطوات الفرز ، أي الميكانيكا والسوائل والإجراءات يتم تقليلها مقارنة ب قياس التدفق الخلوي. ومن الجدير بالذكر، أن MACS يستخدم بالفعل بشكل روتيني في التجارب السريرية لإثراء الخلايا من الدم أو نخاع العظام. ومن المثير للاهتمام، يمكن تطبيق MACS حتى على الخلايا عندما لا توجد علامة سطح الخلية مناسبة، من خلال إدخال وراثيا علامة سطح لجعل الخلايا "المختصة" لخطوات فرز الخلايا المغناطيسية اللاحقة15.
باختصار، يمثل MACS أداة موثوقة وسريعة لإثراء الخلايا السليفة المستقبلة ضوئيا باستخدام علامات سطح الخلية لدراسات الزرع. بالإضافة إلى ذلك، فهي طريقة قابلة للتوظيف بسهولة للتطبيقات السريرية المستقبلية التي تتطلب ظروف GMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر أناند سواروب على توفير فئران Nrl-GFP ، وJochen Haas للحصول على الدعم الفني ، وسيندي بوهم وإيميلي ليسمان تربية الحيوانات.
تم دعم هذا العمل من قبل دويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG): FZT 111 - مركز العلاجات التجديدية درسدن، وبرنامج منح بذور CRTD، وSFB 655، و ProRetina e.V. المؤسسة، وبرنامج الدراسات العليا DIGS-BB درسدن، و Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
