Summary
Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.
Abstract
Sehstörungen und Erblindung durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, d.h. Photorezeptoren, stellen den Hauptgrund für behinderungen in Industrieländern dar. Der Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen dar. Tatsächlich haben jüngste präklinische Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, die am 4. Tag der Neugeborenen mausisoliert wurden, das Potenzial haben, sich nach subretinaler Transplantation in die netzretinale Netzhaut der erwachsenen Maus zu integrieren. Spenderzellen erzeugten eine ausgereifte Photorezeptormorphologie mit inneren und äußeren Segmenten, einem runden Zellkörper an der äußeren Kernschicht und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich haben jüngste Berichte gezeigt, dass Spenderphotorezeptoren sich funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Wirtsmäusen integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung eines solchen Zellersatzansatzes müssen gereinigte Suspensionen der Zellen der Wahl erzeugt und an die richtige Position für eine ordnungsgemäße Integration in das Auge gebracht werden. Für die Anreicherung von Photorezeptor-Vorläufern sollte die Sortierung auf bestimmten Zelloberflächenantigenen basieren, um eine genetische Reporterveränderung von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir magnetisch-assoziierte Zellsortierung (MACS) - Anreicherung von transplantierbaren Stabphotorezeptor-Vorläufern, die aus der neonatalen Netzhaut von photorezeptorspezifischen Reportermäusen auf Basis des Zelloberflächenmarkers CD73 isoliert sind. Die Inkubation mit Anti-CD73-Antikörpern gefolgt von mikro-bead-konjugierten sekundären Antikörpern ermöglichte die Anreicherung von Rod-Photorezeptor-Vorläufern durch MACS auf ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass es einfacher auf GMP-Standards angewendet werden kann und dass große Mengen an Zellen in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion angereicherter Zellsuspensionen in den subretinalen Raum erwachsener Wildtypmäuse führte zu einer 3-fach höheren Integrationsrate im Vergleich zu unsortierten Zellsuspensionen.
Introduction
Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Beeinträchtigung dieses Sinns und Blindheit sind einer der Hauptgründe für Behinderungen in Industrieländern. Die vorherrschende Ursache für Sehbehinderung oder Erblindung ist die Netzhautdegeneration, die durch Photorezeptorzellverlust gekennzeichnet ist, da sie bei Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Kegelstabdystrophie und anderen Bedingungen beobachtet werden kann. Bis heute ist eine wirksame Therapie zur Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens nicht verfügbar. In den Jahren 2006 und 2008 berichteten zwei verschiedene Labore unabhängig voneinander über eine erfolgreiche Transplantation von Rod-Photorezeptor-Vorläuferzellen in adulte Wildtyp-Mäuse-Retinas1,2. So entsteht die Möglichkeit der Photorezeptor-Vorläuferzelltransplantation auch in eine degenerierte Netzhaut, um degenerierte Photorezeptoren zu ersetzen und das Sehvermögen wiederherzustellen. Tatsächlich wurde in jüngster Zeit gezeigt, dass solche transplantierten Photorezeptor-Vorläuferzellen morphologische Kriterien von reifen Wildtyp-Photorezeptoren entlocken, wie z. B. richtig entwickelte äußere Segmente3, synaptische Klemmen in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen und einem runden Zellkörper in der äußeren Kernschicht2-4, sowie die Fähigkeit, sich funktional in die neuronale Schaltanlage des Wirts zu integrieren5-7. Eines der Hauptprinzipien dieser Strategie ist die Verwendung von postnatalen Tag 4 (PN 4, PN0 ist definiert als Tag der Geburt) junge Mäuse Netzhaut, was zu einer Mischung von verschiedenen Zelltypen für die Transplantation. Vor dem Hintergrund einer zukünftigen therapeutischen Anwendung muss diese Mischung für Photorezeptor-Vorläuferzellen gereinigt werden. CD73 wurde als erster Zelloberflächenmarker speziell für junge Photorezeptoren in der Netzhaut8-10beschrieben. Hier zeigen wir eine Photorezeptor-Vorläuferzellreinigungsmethode auf Basis dieses Zelloberflächenmarkers und unter Verwendung der magnetisch-assoziierten Zellsortierungstechnik (MACS). MACS könnte aufgrund der schnellen Sortierzeiten und der einfacheren Anpassung an GMP-Bedingungen Vorteile gegenüber fluoreszierend aktivierten Zellsortiertechniken haben. Wir könnten eine Anreicherung von 90 % und eine bis zu dreifach höhere Integrationsrate nachweisen, wenn wir die angereicherte Population in den subretinalen Raum in erwachsenen Wild-Retinas transplantieren. So sind MACS-basierte Photorezeptor-Vorläuferzellanreicherung und subretinale Transplantation zuverlässige und vielversprechende Techniken für die Entwicklung einer regenerativen therapeutischen Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration.
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Protocol
Ethische Nutzung und Pflege von Tieren Aussage:
Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Gesetzen der Europäischen Union und der Deutschen (Tierschutzgesetz) durchgeführt und hielten sich an die ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der TU Dresden und der Landesdirektion Dresden genehmigt (Zulassungsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Vor dem Starten der Zelldissoziation und Zellsortierung
- Etikettieren Sie drei 15 ml Reaktionsröhrchen mit: Waschen (W), Positiver Bruch (+) und Negativfraktion (-).
2. Netzhautdissoziation
- Enthaupten Sie die PN 4 Welpen mit einer Schere.
- Spülen Sie den Kopf der Welpen kurz in 70% Ethanol gefolgt von Waschen in PBS.
- Übertragen Sie den Kopf auf kalte HBSS und enukleate das Auge (wiederholen Sie diesen Schritt für alle Köpfe). Um zu enukleieren, öffnen Sie die Augenlider und fixieren Sie das Auge mit gekrümmten Zangen an der Sehnervenregion. Ziehen Sie dann das Auge vorsichtig aus dem Orbit.
- Nachdem Sie alle Augen eingeschlossen haben, isolieren Sie die Netzhaut: führen Sie eine geschlossene Schere in den Sehnerv ein und öffnen Sie die Klingen. Peal die RPE / chorid aus. Entfernen Sie die Linsen und Blutgefäße mit gebogenen Zangen.
- Übertragen Sie die isolierten Netzhaut in ein 1,5 ml Reaktionsrohr, das die Papainlösung enthält (bereitgestellt durch das Papain-Dissoziationskit).
- Inkubieren Sie die Netzhaut in der Papainlösung für 30-60 min in einem Wasserbad oder Shaker (400 Rpm) bei 37 °C.
- Während Die Netzhaut in der Papainlösung brütet, pipette 1 ml Ovomucoidlösung zu einem 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "1").
- Fügen Sie 60 l DNase I (10 mg/ml) + 60 l Ovomucoid-Lösung (vom Kit bereitgestellt) + 520 l EBSS in ein 15 ml Reaktionsröhrchen (Label "2" ) ein.
- Nach der Papain-Inkubation die Papainlösung mit den teilweise verdauten Netzhaut in die Reaktionsröhre "2" übertragen.
- Mit einer feuerpolierten Pipette, führen Sie mechanische Dissoziation (10x nach oben und unten).
- Pipette die einzellige Suspension zu Reaktionsrohr "1". Versuchen Sie, 2 Schichten zu erzeugen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig auf die Ovomucoid-Lösung schichten.
- Zentrifuge für 5 min bei 300 x g (ca. 1.300 U/min).
- Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 500 l MACS-Puffer wieder aus.
3. Zellsortierung mit magnetisch zugeordneter Zellsortierung (MACS)
- Fügen Sie den Anti-CD73-Antikörper von X l Ratte zu den 500 l hinzu, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen.
- 5 min auf Eis inkubieren.
- Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 10 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei einer Geschwindigkeit von 300 x g.
- Entfernen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Pellet in 480 l MACS-Puffer wieder auf und fügen Sie 120 l Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Mikroperlen hinzu.
- 15 min auf Eis inkubieren; nicht rühren, schütteln oder mischen.
- Füllen Sie das 15 ml Reaktionsröhrchen mit MACS-Puffer auf 5 ml und zentrifugieren Sie es 5 min bei 300 x g.
- Da das Reaktionsrohr zentrifugiert ist:
- Stellen Sie eine LS-Säule in den magnetischen Ständer ein.
- Setzen Sie den Vortrennfilter auf die LS-Säule.
- Hydratisieren Sie den Vortrennfilter und die LS-Säule mit 3 ml MACS-Puffer und sammeln Sie den MACS-Puffer in das Waschrohr (W).
- Entfernen Sie den Überstand.
- Setzen Sie das Pellet im 500-l-MACS-Puffer wieder auf.
- Laden Sie die 500-l-Zellsuspension in den Filter, fügen Sie dem Filter 1 ml MACS-Puffer hinzu und sammeln Sie den negativen Bruch in das negative Bruch (-) Reaktionsrohr.
- Fügen Sie als Nächstes 3 x 3 ml MACS-Puffer zur Spalte hinzu, um die Zellen abzuwaschen, die nicht an die Spalte gebunden sind.
- Sobald diese 9 ml durch die LS-Säule sind, entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Ständer und installieren Sie sie auf dem positiven Bruch (+) Reaktionsrohr.
- Laden Sie schnell 5 ml MACS-Puffer in die LS-Säule und legen Sie den Kolben in die LS-Säule und drücken Sie ihn nach unten, bis der gesamte Puffer durch die Spalte ist.
- Zentrifugieren Sie das Reaktionsrohr, das die positive Fraktion für 5 min bei 300 x g enthält.
- Den Überstand entfernen, in 500 l MACS-Puffer wieder aufhängen und bei 4 °C halten.
- Zählen Sie die Gesamtanzahl der Zellen mit einem gemeinsamen Zellzählgerät.
- Bereiten Sie eine Zellsuspension aus der positiv sortierten Fraktion vor, die 2 x 105 Zellen/l im MACS-Puffer enthält, und halten Sie sie bei 4 °C
4. Transplantation von MAC-sortierten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die Maus-Retina
- Stellen Sie sicher, dass alle folgenden Lösungen bereit sind: 1 ml sterile PBS oder HBSS, 10 l DNAse I, 1-2 ml steril deionisiert H2O, Aliquots der Zellsuspensionsfraktionen bei 4 °C.
- Anästhetisieren Sie die erwachsene Maus(d. h. 2-4 Monate alt) mit einer intraperitonealen Injektion von Medetomidinhydrochlorid (0,01 mg/10 g Körpergewicht), Ketamin (0,75 mg/10 g Körpergewicht). Dann eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) zur Schmerzlinderung.
- Delate Schüler mit einem Rückgang von Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fix Maus in Mauskopfhalter und unter Stereomikroskop platzieren.
- Tragen Sie einen Tropfen Visidisches Gel auf, um eine Trocknung des Auges zu verhindern.
- Machen Sie ein kleines Loch an der Grenze zwischen Sklera und Hornhaut (bzw. ora serrata) mit einer sterilen 30 G 1/2 in der Nadel.
- Schneiden Sie eine gemeinsame Abdeckung gleiten in kleine (ca. 5 mm x 5 mm) Stücke mit einem Diamant-Stift, legen Sie eines dieser Stücke auf die Hornhaut, so dass eine direkte Visualisierung der Netzhaut.
- Spülen Sie die vorsterilisierte Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.
- Die Mikroliterspritze mit 1 l Zellsuspension beladen, die Nadel tangential durch die Bindehaut und Sklera leiten und unter visueller Kontrolle in die Nasenhälfte der Netzhaut stellen.
- Punch sanft ein Loch in die Netzhaut, bis er den subretinalen Raum erreicht, injizieren Sie die Zellsuspension in den subretinalen Raum.
- Beobachten Sie die bullöse Ablösung der Netzhaut, die einheitlich sein sollte und etwa 1/4 des Netzhautraums ohne Blutungen abdeckt.
- Ziehen Sie die Spritze sanft zurück, das Netzhautloch versiegelt automatisch.
- Spülen Sie die Mikroliterspritze mehrmals mit entionisiertem Wasser.
- Lösen Sie die Maus vom Kopfhalter.
- Wecken Sie die Maus durch Injektion von Atipamozolhydrochlorid zur Umkehrung des Medetomidin-Hydrochlorideffekts.
- Die Maus für die Aufwachzeit in eine warme dunkle Kammer (ca. 25 °C) stellen.
- Die nächsten 2 Tage nach der Transplantation sollte Buprenorphin (0,05 mg/kg Körpergewicht) morgens und nachmittags zur Schmerzlinderung subkutan verabreicht werden.
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Representative Results
Um die Fähigkeit von Stabphotorezeptoren zur Integration in die Mausnetzhaut zu beurteilen, wurde eine Mausreporterlinie verwendet, in der GFP vom neuronalen Retina-Leucin-Reißverschluss (Nrl, Nrl-GFP) Promotor11angetrieben wird. Nrl ist der früheste Marker von Stabphotorezeptoren, die seine Expression bei E12.5 während des gesamten Erwachsenenalters beginnen, was eine spezifische Kennzeichnung von Spenderstab-Photorezeptorzellen ermöglicht.
PN 4 Nrl-GFP Welpen wurden enthauptet und die Augen wurden enukleated. Die Netzhaut wurde dann mit der oben beschriebenen Methode isoliert und dissoziiert. Die resultierende Zellsuspension wurde dann mit CD73-basiertem MACS sortiert (Abbildungen 1 und 2). Nach der MAC-Sortierung haben wir die bei diesem Verfahren erreichte Anreicherung analysiert.
Wie in Abbildung 3Adargestellt, enthielt die anfängliche Zellsuspension (Input) 30,4% GFP-positive Zellen, d.h. Stab-Photorezeptoren. Nach CD73-basierter MAC-Sortierung wurde eine Anreicherung von bis zu 86,9% in der CD73-positiven Fraktion (CD73+) durch Durchflusszytometrie beobachtet. In der CD73-negativen Fraktion (CD73-) wurden nur 9,9 % aller Zellen für GFP positiv nachgewiesen (Abbildung 3A). Die Anreicherung von Nrl-GFP-positiven Zellen nach CD73-basiertem MACS wird zusätzlich nach der Beschichtung in vitro visualisiert (Abbildung 3B).
Nach der MAC-Sortierung wurden die Spenderzellen in der CD73-positiven Fraktion ausgesponnen und auf eine Endkonzentration von 200.000 Zellen/l resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde weiter für die Transplantation in den subretinalen Raum von Wildtyp-Wirtsnetzhaut verwendet (Abbildung 4). Drei bis vier Wochen nach der Transplantation wurden die Wirtsnetzhaut fixiert, isoliert und geschnitten. Mehrere Spenderzellen in die äußere Kernschicht der Wirte integriert und erwarben die Morphologie von reifen Photorezeptoren mit Lokalisierung des Zellkörpers in der äußeren Kernschicht und Bildung von synaptischen Sphärulen und inneren Segmenten (Abbildung 5). Detaillierte Bilder wurden bereits von unserer Gruppe3,8 veröffentlicht, die ein Ergebnis zeigen, das mit FAC-sortierten Zellen vergleichbar ist, die von anderen Gruppen transplantiert wurden, um eine Netzhaut zu beherbergen4,6,10. Konsequent in all diesen Studien ist, dass die transplantierten Zellen an der Injektionsstelle bleiben, die durch die bullöse abgelöste Wirtsnetzhaut definiert wird, und nicht wegwandern. Einige integrieren sich in die Wirtsnetzhaut(d.h. äußere Kernschicht), und einige bleiben im subretinalen Raum3. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die Verteilung der Spenderzellen am Integrationsort vom Typ des verwendeten Mausmodells abhängt5. Bei Transplantationen zwischen C57BL/6J-Mäusen wurden keine akuten Wirts-/Transplantat-Abstoßungszeichen festgestellt.
Abbildung 1. Gesamtschema der subretinalen Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläufern in erwachsene Maus Netzhaut. Spenderzellen von PN 4 Nrl-GFP Welpen werden isoliert, gefolgt von CD73-basierter MAC-Sortierung und in den subretinalen Raum der Maus-Wirt-Retinatransplantate transplantiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren durch MACS. Die zellsuspension, die aus allen gesammelten PN4-Retinas erzeugt wird, wird mit primären Ratten-Anti-CD73-Antikörpern inkubiert, gefolgt von Waschen und Inkubation mit anti-ratatierten Antikörpern, die mit Mikroperlen konjugiert sind. Ungebundene Antikörper werden weggespült. Die Zellsuspension wird durch eine LS-Säule geleitet, die mit einem magnetischen Ständer verbunden ist. Zellen, die durch Antikörper gebunden sind, bleiben an der Spalte befestigt, während die verbleibenden Zellen eluiert und gesammelt werden (CD73-negativer Bruch). Schließlich wird die LS-Säule aus dem magnetischen Ständer entfernt und die restlichen Zellen eluiert und gesammelt (CD73-positive Fraktion). Klicken Sie hier, um den vollständigen Film anzuzeigen.
Abbildung 3. Analyse der nrl-GFP-positiven Zellanreicherung nach CD73-basierter MAC-Sortierung. (A) Vor der Sortierung enthielt die Ursprünglichepopulation der Spenderzellen 30,4 % der Nrl-GFP-positiven Zellen. Nach der MAC-Sortierung konnte eine Anreicherung von GFP-positiven Zellen in der CD73+-Fraktion nachgewiesen werden (86,9%) während die CD73-Fraktion nur geringe Mengen an GFP+-Zellen enthielt (9,9%). (B) Repräsentatives Bild, das das Ergebnis der CD73-basierten MAC-Sortierung von PN4 Nrl-GFP-Zellen demonstriert. 1 Million Zellen aus jeder Fraktion wurden auf lamininbeschichtete Abdeckungen plattiert. Die Zellen wurden 4 Stunden nach der Beschichtung mit 4% PFA für 10 min fixiert. Die Zellen wurden mit DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, 1:20,000) gefärbt. Im Vergleich zur Eingangsfraktion oder der CD73-Fraktion wurde eine signifikante Anreicherung von GFP-positiven Zellen im CD73+-Anteil beobachtet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Subretinale Injektion. Schematische Zeichnung des Transplantationsprozesses in die adulte Maus-Retina. Die Nadel wird durch ein Loch in der Ora serrataeingeführt, durch den vitrealen Raum navigiert, indem sie die Linse nicht berührt und unter visueller Kontrolle an der Netzhaut platziert wird. Durch sanftes Drücken wird die Nadel durch die Netzhaut gestanzt und in den subretinalen Raum gelegt. Schließlich wird die Zellsuspension sorgfältig unter visueller Kontrolle durch Auswertung des Ablösungsprozesses injiziert.
Abbildung 5. Integration transplantierter Photorezeptorzellen. Repräsentatives Bild, das integrierte CD73-basierte MACS-sortierte PN4 Nrl-GFP-Zellen nach der Transplantation in die adulte Maus-Retina zeigt. Transplantierte Photorezeptor-Vorläufer integrieren sich korrekt in die äußere Kernschicht (ONL) und erzeugen eine reife Photorezeptormorphologie.
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Discussion
Die subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um die Integration dieser lichtempfindlichen Zellen in die Wirtsnetzhaut in signifikanten Zahlen1,2zu erreichen. Dies könnte die Etablierung einer Zelltherapie zur Behandlung von netzretinalen degenerativen Erkrankungen in Zukunft ermöglichen6. Die Spenderpopulation von Zellen, die derzeit aus PN 4-Retinas isoliert ist, ist eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen, aus der sich nach subretinaler Injektion nur die Photorezeptor-Vorläuferzellen integrieren. Durch die Verwendung der CD73-basierten MAC-Sortierung kann der Anteil der Photorezeptoren innerhalb der Spenderzellsuspension auf ≈ 90% erhöht werden, was eine etwa dreifach höhere Integrationsrate in Wildtyp-Wirtsnetzim im Vergleich zur unsortierten Zellpopulation8ermöglicht. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil eines schnellen Sortierverfahrens und kann relativ einfach auf GMP-Standards angewendet werden. Die Reinigung von transplantierbaren Photorezeptoren ist von besonderem Interesse angesichts der jüngsten Vorteile für die In-vitro-Generierung von Photorezeptoren aus pluripotenten Stammzellen12-14. Kulturen differenzierter pluripotenter Stammzellen bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen und machen die Verfügbarkeit spezifischer Sortierverfahren zu einer wesentlichen Voraussetzung für ihren zukünftigen Einsatz in Zelltransplantationstherapien.
Nach dem MACS-Reinigungsverfahren sind mehrere Punkte bemerkenswert, die einen Arbeitsablauf ohne größere Störungen gewährleisten. Je höher die Anzahl der zu sortierenden Netzhaut ist, desto mehr Zeit wird für ihre Verdauung benötigt. Nach der Verdauung, während des Sortiervorgangs, muss die Aggregation von Zellen vermieden werden. Dies geschieht vorzugsweise vor Zugabe des sekundären Antikörpers und während seiner Inkubation. In diesem Fall muss das Aggregat sofort mit einer Pipette entfernt werden. Während der Elution des MACS-Puffers beim Sammeln der MACS-negativen Fraktion ist es absolut notwendig, der Spalte nicht mehr als 3 ml hinzuzufügen. Der Druck des Puffers auf die Säule ist zu hoch, wenn mehr Puffer als 3 ml hinzugefügt werden. Dies stört die Bindung des Antikörpers an die Zellen und senkt die Sortiereffizienz. Beim Entfernen der Säule aus dem magnetischen Ständer, um mit dem Sammeln des MACS-positiven Bruchs zu beginnen, muss dieser Schritt schnell erfolgen. Die 5 ml MACS-Puffer sollten der Spalte so schnell wie möglich hinzugefügt werden. Außerdem sollte der Eintauch schnell gesetzt und gedrückt werden, bis der gesamte Puffer durch die Spalte ist. Es ist nicht notwendig, sich um den ausgeübten Druck zu kümmern. Der MACS-Puffer ist isotonisch und kann variiert werden. Es ist möglich, FACS-Puffer, Zellkulturmedium, PBS, EBSS oder HBSS zu verwenden. Die Sterilität des Puffers kann durch Filtern durch eine 0,4 m Filtermembran erreicht werden.
Nach der Anreicherung durch MACS kann eine erfolgreiche Transplantation von Spenderzellen in den subretinalen Raum erreicht werden, indem die folgenden Punkte im Auge behalten werden. Da Photorezeptorzellen sehr empfindlich auf die Behandlung ex vivo reagieren, ist es nicht ratsam, sie auf 4 °C länger als nötig zu halten. Fahren Sie so schnell wie möglich zur Transplantation fort. Beim Einsetzen der Injektionsnadel in den Augapfel ist es wichtig, das Berühren der Linse zu vermeiden, da die relativ scharfe Metallnadel die Linse beschädigen könnte, was zu einer Induktion der linseninduzierten Uveitis führen könnte. Der letzte Schritt auf dem Weg in den subretinalen Raum, das Eindringen der Netzhaut, ist entscheidend. Da es nicht visuell beobachtet werden kann, ob der subretinale Raum erreicht wird, ist es wichtig, ein Gefühl für den richtigen Druck druck- und Geweberesistenz zu entwickeln. Um zu testen, wenn der Nadelkopf richtig platziert ist, könnte ein kleines Volumen angewendet werden und die Ablösung der Netzhaut am Nadelkopf sollte sorgfältig beobachtet werden. Wenn sich eine runde, bullöse Ablösung ohne Blutung bildet, ist die Position korrekt und der Rest der Lösung kann sorgfältig aufgetragen werden. Während der Injektion sollte die Nadel in ihrer Position bleiben, um weitere Schäden am Gewebe zu vermeiden. Das von der Injektionsnadel erzeugte Netzhautloch versiegelt sich von selbst, wenn die Nadel langsam eingefahren wird. Das gesamte Verfahren sollte in der minimalen Zeit möglich durchgeführt werden, um weitere Belastungen und Schäden am Tier zu vermeiden. Während der Transplantation neigt die Zellsuspension dazu, die Mikroliterspritze zu verklumpen und zu blockieren. In diesem Fall wird eine Verdünnung der Zellsuspension mit sterilem PBS oder HBSS vorgeschlagen. Eine weitere Möglichkeit, dieses Problem zu überwinden, besteht darin, der Zellsuspension 1 l DNAse I hinzuzufügen, um DNA-Klumpen aus abgestorbenen Zellen aufzulösen, die dazu neigen, lebende Zellen zusammenzukleben.
Dieses Protokoll ist auf die magnetische Sortierung von Zellen beschränkt. Daher konnten die Zellen für nur einen Marker pro Sortierrunde sortiert werden. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie, bei der Zellen mit verschiedenen Markern (einschließlich physiologischer Eigenschaften sowie verschiedener Zelloberflächenmarker) gleichzeitig sortiert werden konnten, ist dies ein großer Nachteil dieser Technik. Wann immer die Sortierung für verschiedene Marker in einem kurzen Zeitfenster erforderlich ist, könnte die Durchflusszytometrie die bessere Lösung sein. Auch eine Sortierung nach fluoreszierenden Eigenschaften von Zellen, wie transgen exprimiertegfk oder andere Lebenszellmarker, ist mit dieser Technik nicht möglich. Es ist derzeit auf die Verwendung von Zelloberflächenantikörpern beschränkt, die mit magnetischen Perlen konjugiert werden können. Dennoch konnte diese Technik auf der Grundlage der verwendeten technischen Ausrüstung skaliert werden.
Da Miltenyi Biotec derzeit der einzige Anbieter von Magnetzellensortierwerkzeugen ist, gibt es bisher keine Alternative. Zur Zelldissoziation könnten andere Enzyme als Papain(d. h. Trypsin) verwendet werden. Bemerkenswert ist, dass unser Labor die besten Ergebnisse mit Papain erzielt hat, da dies das sanfteste Dissoziationsenzym in unseren Händen zu sein scheint. Das Zeitfenster der Papainverdauung (30-60 min) ist variabel. In diesem Zeitfenster wurde eine optimale Verdauung in unserem Labor erreicht. Je nach Probengröße, Probenqualität und verwendetem Enzym kann eine kürzere oder längere Inkubationszeit erforderlich sein. Es werden individuelle Tests vorgeschlagen.
Da einstufiges MACS nicht so hohe Reinheitsgrade wie die Durchflusszytometrie erreicht, könnte eine mögliche weitere Anwendung dieser Technik eine negative Sortierung unerwünschter und potenziell schädlicher Zellen sein. Dort kann die Zellfraktion, die für einen bestimmten Zelloberflächenmarker positiv, aber nicht von Interesse ist, aussortiert werden, sodass der Anteil des Interesses im Durchfluss isoliert bleibt. Dies könnte im Voraus oder nach einem positiven Sortierschritt erfolgen und ermöglicht die weitere Diskriminierung von Zellen mit unterschiedlichen Zelloberflächenmarkern sowie die Entfernung unerwünschter Zellen, wie Feederschichtzellen oder undifferenzierter Zellen aus pluripotenten Stammzellkulturen mit ihrem potenziellen tumorengenen Risiko. Daher könnte MACS für die Reinigung von Photorezeptoren aus ES- oder iPS-Zellkulturen in möglichen zukünftigen therapeutischen Anwendungen geeignet sein, da es eine sanfte, schnelle und einfache Behandlung für die Reinigung großer Mengen kultivierter Zellen darstellt. MACS könnte leicht auf GMP-Bedingungen angewendet werden, da die Details der Sortierschritte, d. h. Mechanik, Flüssigkeiten und Verfahren im Vergleich zur Durchflusszytometrie reduziert sind. Bemerkenswert ist, dass MACS bereits routinemäßig in klinischen Studien zur Anreicherung von Zellen aus Blut oder Knochenmark eingesetzt wird. Interessanterweise kann MACS sogar auf Zellen angewendet werden, wenn kein geeigneter Zelloberflächenmarker vorhanden ist, indem genetisch ein Oberflächenmarker eingeführt wird, um Zellen für nachfolgende magnetische Zellsortierschritte15"kompetent" zu machen.
Zusammenfassend stellt MACS ein zuverlässiges und schnelles Werkzeug zur Anreicherung von Photorezeptor-Vorläuferzellen mithilfe von Zelloberflächenmarkern für Transplantationsstudien dar. Darüber hinaus ist es eine leicht zu verwendende Methode für zukünftige klinische Anwendungen, die GMP-Bedingungen erfordern.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Anand Swaroop für die Bereitstellung von Nrl-GFP-Mäusen, Jochen Haas für technische Unterstützung und Sindy Böhme und Emely Lessmann für die Tierhaltung.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Zentrum für Regenerative Therapien Dresden, dem CRTD Seed Grant Program, dem SFB 655 und dem ProRetina e.V. unterstützt. Stiftung, das DIGS-BB Graduate Program Dresden und die Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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