Summary
Трансплантация клеток представляет собой стратегию лечения дегенерации сетчатки, характеризующуюся потерей фоторецептора. Здесь мы описываем метод обогащения трансплантируемых фоторецепторов и их субретинального прививки взрослым мышам.
Abstract
Ухудшение зрения и слепота в связи с потерей светочувствия клеток сетчатки, т.е. фоторецепторов, является основной причиной инвалидности в промышленно развитых странах. Замена вырожденных фоторецепторов путем трансплантации клеток представляет собой возможный вариант лечения в будущих клинических применениях. Действительно, недавние доклинарические исследования показали, что незрелые фоторецепторы, изолированные от сетчатки неонатальной мыши в послеродовой день 4, имеют потенциал для интеграции во взрослую сетчатку мыши после субретинальной трансплантации. Донорские клетки создали зрелую морфологию фоторецептора, включая внутренние и внешние сегменты, круглое клеточное тело, расположенное на внешнем ядерном слое, и синаптические терминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток. Действительно, последние сообщения показали, что донорские фоторецепторы функционально интегрируются в нейронную схему мышей-хозяйцев. Для будущего клинического применения такого клеточного подхода очищенные суспензии клеток по выбору должны быть сгенерированы и помещены в правильное положение для правильной интеграции в глаз. Для обогащения прекурсоров фоторецептора сортировка должна основываться на специфических поверхностных антигенах клеток, чтобы избежать генетической модификации донорских клеток. Здесь мы показываем магнитно-ассоциированную сортировку клеток (MACS) - обогащение трансплантируемых прекурсоров фоторецептора стержня, изолированных от неонатальной сетчатки мышей-репортеров, специфичных для фоторецепторов, на основе маркера поверхности клетки CD73. Инкубация с антителами anti-CD73 последуха за micro-бисером конъюгированные вторичные антитела позволили обогащение прекурсоров фоторецептора стержня MACS до приблизительно 90%. По сравнению с цитометрией потока, MACS имеет то преимущество, что он может быть легче применяться к стандартам GMP и что большое количество клеток может быть отсортировано в относительно короткие периоды времени. Инъекция обогащенных клеточных суспензий в подретинарное пространство взрослых мышей дикого типа привела к в 3-кратной более высокой скорости интеграции по сравнению с несортированной клеточной подвеской.
Introduction
Видение является одним из основных чувств людей. Нарушение этого чувства и слепота являются одной из основных причин инвалидности в промышленно развитых странах. Основной причиной нарушения зрения или слепоты является дегенерация сетчатки, характеризующаяся потерей фоторецепторных клеток, так как она может наблюдаться при макулярной дегенерации, пигменте ретинита, дистрофии конусообразного стержня и других условиях. На сегодняшний день эффективной терапии для восстановления утраченной зрения нет. В 2006 и 2008 годах две различные лаборатории сообщили, независимо друг от друга, успешная трансплантация стержневых фоторецепторов клеток-предшественников в взрослых дикихмышей сетчатки 1,2. Таким образом, возникает возможность пересадки клеток-предшественников фоторецептора также в вырожденную сетчатку, чтобы заменить вырожденные фоторецепторы и восстановить зрение. Действительно, недавно было продемонстрировано, что такие пересаженные клетки-предшественники фоторецептора вызывают морфологические критерии зрелых фоторецепторов дикого типа,таких как правильно разработанные внешние сегменты 3, синаптическиетерминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток и круглого клеточного тела, расположенного во внешнем ядерном слое2-4,а такжевозможность функционально интегрироваться в нейроцепа 5-7. Одним из основных принципов этой стратегии является использование послеродового дня 4 (PN 4, PN0 определяется как день рождения) молодых мышей сетчатки, в результате чего смесь различных типов клеток для трансплантации. На фоне будущего терапевтического применения, эта смесь должна быть очищена для клеток-предшественников фоторецептора. CD73 был описан как первый маркер поверхности клетки, специфичный для молодых фоторецепторов всетчатке 8-10. Здесь мы демонстрируем метод очистки клеток-предшественников фоторецептора, основанный на этом маркере поверхности клетки и с использованием метода сортировки клеток, связанных с магнитным покрытием (MACS). MACS может иметь преимущества по сравнению с флуоресцентными методами сортировки клеток, из-за быстрого времени сортировки и более легкой адаптации к условиям GMP. Мы могли бы продемонстрировать обогащение на 90% и более высокий уровень интеграции в 3 раза при пересадке обогащенной популяции в подретинальный космос в сетчатке взрослого дикого типа. Таким образом, фоторецептор на основе MACS-прекурсоров и субретинальной трансплантации являются надежными и перспективными методами разработки регенеративной терапевтической стратегии лечения дегенерации сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое использование и уход за животными заявление:
Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с законами Европейского союза и Германии (Tierschutzgesetz) и соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных ТУ Дрездена и Landesdirektion Дрезден (номер утверждения: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Перед началом диссоциации клеток и сортировки клеток
- Этикетка три 15 мл реакционной трубки с: Мытье (W), Положительная фракция (я) и Отрицательная фракция (-).
2. Диссоциация сетчатки
- Обезглавить PN 4 щенков с помощью ножниц.
- Промыть голову щенков в ближайшее время в 70% этанола следуют стирки в PBS.
- Перенесите голову на холодный HBSS и окуттете глаз (повторите этот шаг для всех голов). Чтобы приутупляться, откройте веки и зафиксировать глаз изогнутыми миппами в области зрительного нерва. Затем осторожно вытащите глаз с орбиты.
- После enucleating все глаза, изолировать сетчатку: ввести закрытые ножницы в зрительный нерв и открыть лезвия. Peal RPE / хорид из. Удалите линзы и кровеносные сосуды с помощью изогнутых типсов.
- Перенесите изолированную сетчатку в реакционной трубке 1,5 мл, содержащей раствор папаина (предоставленный комплектом диссоциации папаина).
- Инкубировать сетчатку в растворе папаина в течение 30-60 мин в водяной бане или шейкере (400 об/мин) при 37 градусах Цельсия.
- В то время как сетчатка инкубируют в растворе папаина, пипетка 1 мл раствора овомукоида в 15 мл реакционной трубки (метка "1").
- Добавьте 60 мкл DNase I (10 мг/мл) и 60 мкл раствора овомукоида (предоставленный комплектом) и 520 мкл ЭБС в 15 мл реакционной трубки (метка "2").
- После инкубации папаина перенесите раствор папаина, содержащий частично переваренную сетчатку, в реакционной трубке "2".
- Используя отполированную огнем пипетку, выполняйте механическую диссоциацию (10x вверх и вниз).
- Пипетт одноклеточной подвески для реакции трубки "1". Попробуйте создать 2 слоя, аккуратно наслоения клеточной подвески на верхней части раствора овомукоида.
- Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g (примерно 1300 об/мин).
- Отбросьте супернатант и ассизент клетки в 500 мкл буфера MACS.
3. Сортировка клеток с использованием магнитной сортировки связанных клеток (MACS)
- Добавьте антитела крысы X и х 73 к 500 л для достижения окончательной концентрации 10 мкг/мл.
- Инкубация 5 мин на льду.
- Заполните 15 мл реакционной трубки до 10 мл буфером MACS и центрифуга его в течение 5 минут со скоростью 300 х г.
- Удалите супернатант.
- Перепробись гранулы в буфере MACS в 480 йл и добавьте 120 мкл козьих анти-крыс IgG микробусов.
- Инкубация 15 мин на льду; не агитировать, встряхнуть или смешать его.
- Заполните 15 мл реакционной трубки до 5 мл буфером MACS и центрифуга его в течение 5 мин при 300 х г.
- Как реакция трубки центрифугирована:
- Отрегулируйте колонку LS в магнитную подсюх.
- Поместите предсепарацию фильтра поверх колонки LS.
- Гидратировать фильтр преспарации и LS колонку с 3 мл буфера MACS и собирать буфер MACS в стиральную (W) трубку.
- Удалите супернатант.
- Повторное производство гранул в буфере MACS в 500 йл.
- Загрузите 500 мкл клеточной подвески к фильтру, затем добавьте 1 мл буфера MACS в фильтр и соберите отрицательную фракцию в отрицательную фракцию (-) реакционной трубки.
- Затем добавьте 3 x 3 мл буфера MACS в столбец, чтобы смыть ячейки, которые не привязаны к столбецу
- После того, как эти 9 мл через LS колонки, удалить столбец из магнитного стенда и установить его на верхней части положительной фракции (я) реакционной трубки.
- Быстро загрузите 5 мл буфера MACS в колонку LS и поместите поршень в колонку LS и нажмите его вниз, пока весь буфер не будет через столбец.
- Центрифуга реакционной трубки, содержащей положительную фракцию в течение 5 мин при 300 x g.
- Удалите супернатант, повторное течение 500 мл буфера MACS и держите при 4 градусах Цельсия.
- Подсчитайте общее количество ячеек с помощью общего устройства подсчета ячеек.
- Подготовьте подвеску клетки от положительной отсортированной фракции, содержащей2 x 10 5 ячеек/хл в буфере MACS, и держитесь на уровне 4 градусов по Цельсию
4. Трансплантация MAC-сортированы фоторецептора Прекурсор клетки в мышь сетчатки
- Убедитесь в том, чтобы все следующие решения готовы: 1 мл стерильных PBS или HBSS, 10 мкл DNAse I, 1-2 мл стерильных деионизированных H2O, aliquots фракций клеточной подвески при 4 градусов по Цельсию.
- Анестезия взрослой мыши(т.е. 2-4 месяца) с внутриперитонеальной инъекцией гидрохлорида медетомидина (0,01 мг/10 г массы тела), кетамина (0,75 мг/10 г массы тела). Затем сделайте подкожное введение бупренорфина (0,05 мг/кг массы тела) для облегчения боли.
- Расширяют зрачки с падением фенилэфрина 2,5%-Тропикамид 0,5%.
- Зафиксните мышь в держателе головы мыши и поместите под стерео микроскопом.
- Нанесите каплю visidic геля, чтобы предотвратить высыхание глаза.
- Сделайте небольшое отверстие на границе между склерой и роговицей (соответственно ora serrata)с помощью стерильной 30 G 1/2 в игле.
- Вырезать общий слайд крышки на небольшие (примерно 5 мм х 5 мм) штук с помощью алмазной ручки, место одного из этих частей на верхней части роговицы, что позволяет прямой визуализации сетчатки.
- Промыть предстерилизированный микролитер шприц несколько раз с деионизированной водой.
- Загрузите микролитерный шприц с 1 л клеточной подвески, прямой иглой касательно через конъюнктиву и склеру и поместите под визуальный контроль в носовой половине сетчатки.
- Удар осторожно отверстие в сетчатке до достижения подретинального пространства, вводить подвеску клетки в подтритеинное пространство.
- Наблюдайте бычье отслоение сетчатки, которое должно быть однородным, покрывая приблизительно 1/4 пространства сетчатки без каких-либо кровотечений.
- Свяйте шприц осторожно, отверстие сетчатки уплотняет автоматически.
- Промыть микролитер шприц несколько раз с деионизированной водой.
- Отпустите мышь из держателя головы.
- Проснитесь мыши путем введения атипамозола гидрохлорида для разворота медетомидина гидрохлоридного эффекта.
- Поместите мышь для пробуждения в теплой темной камере (примерно 25 градусов по Цельсию).
- Следующие 2 дня после трансплантации бупренорфин (0,05 мг/кг массы тела) следует вводить подкожной инъекцией утром и днем для облегчения боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы оценить способность стержня фоторецепторов для интеграции в сетчатке мыши, мышь репортер линия была использована, в которой GFP управляется нервной сетчатки лейцина молнии (Nrl, Nrl-GFP) промоутер11. Nrl является самым ранним маркером фоторецепторов стержня, начиная свое выражение на E12.5 на протяжении всей взрослой жизни, что позволяет конкретной маркировки донорского стержня фоторецептор клеток.
PN 4 Детеныши Nrl-GFP были обезглавлены, а глаза были обучены. Сетчатки были затем изолированы и разобщены с помощью метода, описанного выше. Полученная подвеска ячейки была отсортирована с помощью MACS на основе CD73(рисунки 1 и 2). После сортировки MAC мы проанализировали обогащение, достигнутое в ходе этой процедуры.
Как показано на рисунке 3A, начальная подвеска ячейки (вход) содержала 30,4% GFP-положительных ячеек, т.е. стержень фоторецепторов. После сортировки MAC на основе CD73, обогащение до 86,9% в CD73-положительной фракции (CD73) наблюдалось цитометрией потока. В CD73-отрицательная фракция (CD73-) только 9,9% всех клеток были положительно обнаружены для GFP (Рисунок 3A). Обогащение положительных ячеек Nrl-GFP после CD73-основе MACS дополнительно визуализировано после покрытия in vitro (рисунок 3B).
После сортировки MAC донорские клетки в CD73-положительной фракции были закручены вниз и повторно использованы до окончательной концентрации 200 000 клеток/мл. Эта клеточная подвеска была дополнительно использована для трансплантации в подретинального пространства сетчатки хозяина дикого типа(рисунок 4). Через три-четыре недели после трансплантации сетчатка хозяина была исправлена, изолирована и секционирована. Несколько донорских клеток интегрированы во внешний ядерный слой хозяев и приобрели морфологию зрелых фоторецепторов с локализацией клеточного тела во внешнем ядерном слое и образованием синаптических сферул и внутренних сегментов(рисунок 5). Подробные фотографии были опубликованы ранее нашейгруппой 3,8 показаны результаты сопоставимы с FAC-отсортированных клеток пересажены для размещениясетчатки другими группами 4,6,10. Последовательно во всех этих исследованиях, что пересаженные клетки остаются в месте инъекции, определяется бычьей отдельной сетчатки хозяина, и не мигрируют прочь. Некоторые интегрируются в сетчатку хозяина(т.е. внешний ядерный слой), а некоторые остаются в подретинальной пространстве3. Кроме того, было показано, что распределение донорских клеток в месте интеграции зависит от типа модели мыши, используемой5. При трансплантации между мышами C57BL/6J не было обнаружено никаких острых признаков отторжения хозяина/трансплантата.
Рисунок 1. Общая схема субретинальной трансплантации macS очищенных прекурсоров фоторецептора во взрослую сетчатку мыши. Донорские клетки из PN 4 Nrl-GFP щенков изолированы, а затем CD73 основе MAC сортировки и пересажены в подретинального пространства мыши принимающей сетчатки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 2. Обогащение трансплантируемых фоторецепторов MACS. Клеточная суспензия, генерируемая из всех собранных сетчатк PN4, инкубируется первичными антителами крысы против CD73, за которыми следует мытье и инкубация анти крысиными антителами, спряженными с микробусами. Несыханные антитела смываются. Подвеска ячейки проходит через LS-колонку, которая соединена с магнитной подгоной. Клетки, связанные антителами, остаются прикрепленными к столбецу, в то время как остальные клетки элайтятся и собираются (CD73-отрицательная фракция). Наконец, LS-колонка удаляется из магнитного стенда, а остальные клетки элайтированы и собраны (CD73-положительная фракция). Нажмите здесь, чтобы просмотреть полный фильм.
Рисунок 3. Анализ положительного обогащения клеток Nrl-GFP после сортировки MAC на основе CD73. A)Перед сортировкой начальная популяция донорских клеток содержала 30,4% положительных клеток Nrl-GFP. После сортировки MAC, обогащение GFP-положительных клеток может быть обнаружено в фракции CD73 "(86,9%) в то время как CD73-фракция содержала лишь небольшое количество ячеек GFP (9,9%). (B)Представительное изображение, демонстрирующее результат CD73-сортировки MAC ячеек PN4 Nrl-GFP. 1 миллион клеток из каждой фракции были покрыты ламинин покрытием coverslips. Клетки были зафиксированы 4 часа после покрытия с 4% PFA в течение 10 мин. Клетки были окрашены DAPI (4',6-diamidino-2-фенилиндол, 1:20,000). Значительное обогащение GFP-положительных ячеек в фракции CD73 "наблюдалось по сравнению с входной фракцией или фракцией CD73. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 4. Субретинальная инъекция. Схематический рисунок процесса трансплантации в сетчатку взрослой мыши. Игла вставляется через отверстие в ора серрата, перемещаться через стекловидное пространство, избегая прикосновения к объективу и помещается на сетчатке под визуальным контролем. Нежным нажатием игла прокалывания через сетчатку и помещается в подретинального пространства. В конце концов, подвеска клетки вводится тщательно под визуальным контролем, оценивая процесс отслоения.
Рисунок 5. Интеграция пересаженных фоторецепторных клеток. Представитель изображение с изображением интегрированных CD73 основе MACS отсортированы PN4 Nrl-GFP клетки после трансплантации во взрослую сетчатку мыши. Пересаженные прекурсоры фоторецептора правильно интегрируются во внешний ядерный слой (ONL) и генерируют зрелую морфологию фоторецептора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Субретинальная трансплантация клеток-предшественников фоторецептора представляет собой надежный инструмент для достижения интеграции этих светочувствительных клеток в сетчатку хозяина взначительных количествах 1,2. Это может позволить создать клеточную терапию для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки вбудущем 6. Донорская популяция клеток, в настоящее время изолированная от сетчатки PN 4, представляет собой смесь различных типов клеток, из которых только клетки-предшественники фоторецептора интегрируются после субретинальной инъекции. С помощью CD73 основе MAC-сортировки, доля фоторецепторов в подвеске донорских клеток может быть увеличена до ≈ 90%, что позволяет примерно в 3 раза выше скорость интеграции в дикого типа принимающей сетчатки по сравнению с несортированной популяцииклеток 8. По сравнению с цитометрией потока MACS имеет преимущество быстрой процедуры сортировки и что она может быть относительно легко применена к стандартам GMP. Очистка трансплантируемых фоторецепторов представляет особый интерес в свете последних преимуществ для поколения фоторецепторов in vitro из плюрипотентныхстволовых клеток 12-14. Культуры дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток состоят из различных типов клеток, что делает наличие конкретных процедур сортировки необходимым условием для их будущего использования в клеточной трансплантационной терапии.
В соответствии с процедурой очистки MACS, несколько пунктов примечательны, обеспечивая рабочий процесс без серьезных нарушений. Чем больше количество сетчатки будет отсортировано, тем больше времени требуется для их пищеварения. После пищеварения, во время процедуры сортировки, агрегации клеток следует избегать. Это происходит предпочтительно до добавления вторичного антитела и во время его инкубации. В этом случае агрегат должен быть немедленно удален с помощью пипетки. Во время элауции буфера MACS при сборе MACS-отрицательной фракции, абсолютно необходимо не добавлять более 3 мл в столбец. Давление буфера на столбец будет слишком высоким, если будет добавлено больше буфера, чем 3 мл. Это нарушает связывание антитела к клеткам и снижает эффективность сортировки. При удалении столбца с магнитного стенда, чтобы начать сбор MACS-положительной фракции, этот шаг должен быть сделан быстро. 5 мл буфера MACS следует добавить в столбец как можно быстрее. Кроме того, погружение должно быть поставить и нажата быстро, пока весь буфер через столбец. Не стоит беспокоиться о оказываемом давлении. Буфер MACS является изотоническим и может быть разнообразным. Можно использовать буфер FACS, среду клеточной культуры, PBS, EBSS или HBSS. Стерильность буфера может быть достигнута путем фильтрации через мембрану фильтра 0,4 мкм.
После обогащения MACS, успешная трансплантация донорских клеток в подретинального пространства может быть достигнуто путем учета следующих точек. Так как фоторецептор клетки, кажется, очень чувствительны к лечению ex vivo, это не рекомендуется держать их на 4 градусов дольше, чем это необходимо. Продолжить трансплантацию как можно быстрее. При вставке иглы инъекции в глазное яблоко, важно, чтобы избежать прикосновения к объективу, как относительно острые металлические иглы могут повредить объектив в результате индукции линзы индуцированной увеит. Последний шаг на пути к подретиналальной пространстве, проникновение сетчатки, имеет решающее значение. Так как он не может визуально наблюдать ли подретинального пространства достигнута важно развивать чувство правильного нажатия давления и сопротивления тканей. Для проверки, если голова иглы расположена правильно, небольшой объем может быть применен и отслоение сетчатки на голове иглы должны быть тщательно соблюдены. Если образуется круглый, буллозный отслоение без кровотечения, позиция правильная, а остальную часть раствора можно применять осторожно. Во время инъекции игла должна оставаться в своем положении, чтобы избежать дальнейшего повреждения тканей. Отверстие сетчатки, созданное иглой для инъекций, запечатывание само по себе, если игла медленно убирается. Вся процедура должна быть сделана в минимальное количество времени можно избежать дальнейшего стресса и повреждения животного. Во время трансплантации, подвеска клетки, как правило, слипаются и блокируют микролитер шприц. Если это произойдет, разбавление клеточной подвески с использованием стерильных PBS или HBSS предлагается. Еще одна возможность преодолеть эту проблему заключается в том, чтобы добавить 1 мкл ДНК I в клеточной суспензии, чтобы растворить сгустки ДНК из мертвых клеток, которые, как правило, клей живых клеток вместе.
Этот протокол ограничивается магнитной сортировкой клеток. Таким образом, ячейки могут быть отсортированы только для одного маркера за сортировку раунда. По сравнению с цитометрией потока, где клетки могут быть отсортированы с помощью различных маркеров (в том числе физиологических свойств, а также различных маркеров поверхности клеток) в то же время, это является основным недостатком этой техники. Всякий раз, когда сортировка для различных маркеров в короткое время окно необходимо, поток цитометрии может быть лучшим решением. Кроме того, сортировка на флуоресцентные свойства клеток, как трансгенно выраженные GFP или другие маркеры клеток жизни не возможно с помощью этой техники. В настоящее время он ограничивается использованием антител поверхности клеток, которые могут быть спряжены с магнитными бусинами. Тем не менее этот метод можно было бы масштабировать на основе используемого технического оборудования.
Поскольку Miltenyi Biotec в настоящее время является единственным поставщиком инструментов сортировки магнитных клеток, на сегодняшний день альтернативы нет. Для диссоциации клеток можно использовать другие ферменты,помимо папаина (т.е. трипсина). Следует отметить, что наша лаборатория достигла наилучших результатов с папаином, так как это, кажется, самый нежный фермент диссоциации в наших руках. Время пищеварения папаина (30-60 мин) является переменной. За это время в нашей лаборатории было достигнуто оптимальное пищеварение. Более короткое или более длительное время инкубации может потребоваться в зависимости от размера выборки, качества образца и используемого фермента. Предлагается индивидуальное тестирование.
Учитывая, что одношаговая MACS не достигает уровня чистоты, такого высокого, как цитометрия потока, возможным дальнейшим применением этого метода может быть отрицательная сортировка нежелательных и потенциальных вредных клеток. Там, фракция клетки положительная для данного маркера поверхности клетки, но не представляет интереса может быть улаортирована, оставляя часть интереса изолированы в потоке до конца. Это может быть сделано заранее или после положительного шага сортировки и позволяет дальнейшей дискриминации клеток с использованием различных маркеров поверхности клеток, а также удаление нежелательных клеток, как клетки фидерного слоя или недифференцированных клеток из плюрипотентных культур стволовых клеток с их потенциальным опухолевым риском. Таким образом, MACS может быть подходящим для очистки фоторецепторов из ES или iPS клеточных культур в возможных будущих терапевтических приложений, поскольку она представляет собой мягкое, быстрое и простое лечение для очистки большого количества культурных клеток. MACS можно легко применять к GMP-условиям, так как детали этапов сортировки, т.е. механики, жидкости и процедуры сокращаются по сравнению с цитометрией потока. Примечательно, что MACS уже регулярно используется в клинических испытаниях для обогащения клеток из крови или костного мозга. Интересно, что MACS может быть даже применен на клетках, когда нет подходящего маркера поверхности клетки присутствует, генетически вводя маркер поверхности, чтобы сделать клетки "компетентными" для последующих шагов сортировкимагнитных клеток 15.
Таким образом, MACS представляет собой надежный и быстрый инструмент для обогащения клеток-предшественников фоторецептора с использованием маркеров поверхности клеток для трансплантации исследований. Кроме того, это легко используемый метод для будущих клинических применений, которые требуют GMP-условий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Ананд Сваруп за предоставление мышей Nrl-GFP, Иохена Хааса за техническую поддержку, а Синди Бёме и Эмели Месман для животноводства.
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): ФЗТ 111 - Центр регенеративной терапии Дрездена, CRTD Семенной Грант программы, SFB 655, и ProRetina e.V. фонд, программа выпускников DIGS-BB Дрездена и Фонд пара Сиенсия электронной Текноологии (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
