Summary
השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.
Abstract
ליקוי ראייה ועיוורון עקב אובדן תאי חישת האור של הרשתית, כלומר פוטורצפטורים, מייצגים את הסיבה העיקרית לנכות במדינות המתועשות. החלפת פוטורצפטורים מנוון על ידי השתלת תאים מייצגת אפשרות טיפול אפשרית ביישומים קליניים עתידיים. ואכן, מחקרים פרה-קליניים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים לא בוגרים, מבודדים מהרשתית של עכבר יילודים ביום 4 שלאחר הלידה, יש פוטנציאל להשתלב ברשתית העכבר הבוגרת לאחר השתלת תת-רשתית. תאים תורמים יצרו מורפולוגיה פוטורצפטורית בוגרת הכוללת מקטעים פנימיים וחיצוניים, גוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית, ומסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים. ואכן, דיווחים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים תורמים משתלבים באופן פונקציונלי במעגלים העצביים של עכברים מארחים. עבור יישום קליני עתידי של גישה כזו החלפת תאים, השעיות מטוהרות של התאים של בחירה צריך להיווצר ולהציב בעמדה הנכונה עבור שילוב תקין לתוך העין. להעשרה של מבשרי פוטורצפטור, המיון צריך להיות מבוסס על אנטיגנים ספציפיים משטח התא כדי למנוע שינוי כתב גנטי של תאים תורמים. כאן אנו מראים מיון תאים הקשורים מגנטית (MACS) - העשרה של מבשרי מוט מושתל photoreceptor מבודד מן הרשתית יילודים של עכברי כתב ספציפי photoreceptor מבוסס על סמן פני התא CD73. דגירה עם נוגדנים נגד CD73 ואחריו נוגדנים משניים מצומדים מיקרו חרוזים אפשרו העשרה של מבשרי פוטורצפטור מוט על ידי MACS לכ -90%. בהשוואה cytometry זרימה, MACS יש את היתרון כי זה יכול להיות קל יותר להחיל על תקני GMP וכי כמויות גבוהות של תאים ניתן למיין בתקופות זמן קצר יחסית. הזרקת השעיות תאים מועשרות לחלל התת-קרקעי של עכברים בוגרים מסוג פראי הביאה לשיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בהשוואה למתלי תאים לא ממוינים.
Introduction
חזון הוא אחד החושים העיקריים של בני האדם. פגיעה בתחושה זו ועיוורון הם אחת הסיבות העיקריות לנכות במדינות המתועשות. הסיבה העיקרית לליקוי ראייה או עיוורון היא ניוון רשתית, המאופיינת באובדן תאים פוטורצפטורים, שכן ניתן לראותה בניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה, ניוון חרוט-מוט ותנאים אחרים. נכון להיום, טיפול יעיל כדי לשחזר את הראייה שאבדו אינו זמין. בשנים 2006 ו -2008 שתי מעבדות שונות דיווחו, ללא תלות זו בזו, השתלה מוצלחת של תאי מבשר פוטורצפטור מוט לעכברים מסוג פראי בוגר רשתית1,2. לכן, הנובעים האפשרות של השתלת תא מבשר photoreceptor גם לתוך רשתית מנוונת, להחליף פוטורצפטורים מנוונים ולשחזר את הראייה. אכן, הוכח לאחרונה, כי תאים מבשר פוטורצפטור מושתלים כאלה מעוררים קריטריונים מורפולוגיים של קולטני פוטורצפטורים מסוג פראי בוגרים, כגון מקטעים החיצוניים שפותחו כראוי3, מסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים וגוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית2-4, כמו גם את היכולת להשתלב באופן פונקציונלי במעגלים העצביים המארחים5-7. אחד העקרונות העיקריים של אסטרטגיה זו הוא השימוש ביום שלאחר הלידה 4 (PN 4, PN0 מוגדר כיום לידה) רשתית עכברים צעירים, וכתוצאה מכך תערובת של סוגי תאים שונים להשתלה. על רקע יישום טיפולי בעתיד, תערובת זו צריכה להיות מטוהרת עבור תאים מבשר photoreceptor. CD73 תוארה כסמן פני התא הראשון הספציפי עבור פוטורצפטורים צעירים ברשתית8-10. כאן, אנו מדגימים שיטת טיהור תאים מבשר פוטורצפטור המבוססת על סמן משטח תא זה ועם השימוש בטכניקת מיון התאים המגנטיים (MACS). ל- MACS עשויים להיות יתרונות בהשוואה לטכניקות מיון תאים המופעלות על-ידי פלואורסצנט, עקב זמני מיון מהירים והתאמה קלה יותר לתנאי GMP. אנחנו יכולים להדגים העשרה של ~ 90% ושיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בעת השתלת האוכלוסייה המועשרת לחלל התת-קרקעי ברשתיות מסוג בר למבוגרים. לכן, MACS מבוססי photoreceptor הקדמה העשרת תאים השתלה subretinal, הם טכניקות אמינות ומבטיחות לפיתוח אסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית לטיפול ניוון רשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שימוש אתי וטיפול בבעלי חיים הצהרה:
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוקי האיחוד האירופי והחוקים הגרמניים (Tierschutzgesetz) ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של TU דרזדן ואת לנדסדריקציה דרזדן (מספר אישור: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. לפני תחילת ניתוק תאים ומיון תאים
- תווית שלושה צינורות תגובה 15 מ"ל עם: לשטוף (W), שבר חיובי (+) ושבר שלילי (-).
2. דיסוציאציה של רשתית
- ערפו את ראשם של גורי PN 4 בעזרת מספריים.
- לשטוף את הראש של הגורים זמן קצר 70% אתנול ואחריו כביסה PBS.
- מעבירים את הראש ל- HBSS קר ומעבירים את העין (חזרו על שלב זה לכל הראשים). כדי להסתגר, לפתוח את העפעפיים ולקבע את העין עם מלקחיים מעוגלים באזור עצב הראייה. ואז למשוך את העין בזהירות מחוץ למסלול.
- לאחר קיזוז כל העיניים, לבודד את הרשתית: להציג מספריים סגורים לתוך עצב הראייה ולפתוח את הלהבים. Peal RPE / chorid החוצה. הסר את העדשות וכלי הדם באמצעות מלקחיים מעוגלים.
- מעבירים את הרשתית המבודדת לצינור תגובה של 1.5 מ"ל המכיל את פתרון הפפאין (המסופק על ידי ערכת ניתוק הפפאין).
- דגירה הרשתיות בתמיסת פפאין במשך 30-60 דקות באמבט מים או שייקר (400 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.
- בעוד רטינות דגירה בתמיסת פפאין, פיפטה 1 מ"ל של פתרון ovomucoid צינור תגובה 15 מיליליטר (תווית "1").
- הוסף 60 μl של DNase I (10 מ"ג / מ"ל) + 60 μl של פתרון ovomucoid (מסופק על ידי הערכה) + 520 μl של EBSS לצינור תגובה 15 מ"ל (תווית "2").
- לאחר דגירה פפאין, להעביר את פתרון פפאין המכיל את הרשתית מתעכל חלקית צינור תגובה "2".
- באמצעות פיפטה מלוטשת אש, לבצע ניתוק מכני (10x למעלה ולמטה).
- פיפטה השעיית תא יחיד לצינור תגובה "1". נסה ליצור 2 שכבות על ידי שכבות בעדינות את המתלה התא על גבי הפתרון ovomucoid.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (כ-1,300 סל"ד).
- השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 500 μl של מאגר MACS.
3. מיון תאים באמצעות מיון תאים משויך מגנטי (MACS)
- הוסף נוגדן נגד CD73 עכברוש X μl ל 500 μl על מנת להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- דגירה 5 דקות על קרח.
- מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-10 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 300 x גרם.
- הסר את העל-טבעי.
- Resuspend גלולה ב 480 μl MACS חוצץ ולהוסיף 120 μl של עז נגד חולדה IgG microbeads.
- דגירה 15 דקות על קרח; אין להתסיס, לנער או לערבב אותו.
- מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-5 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
- כמו צינור התגובה הוא צנטריפוגה:
- כוונן עמודת LS לתוך המעמד המגנטי.
- הצב את מסנן קדם-השילוח מעל עמודת ה- LS.
- לחות את מסנן preseparation ואת עמודת LS עם 3 מיליליטר MACS מאגר ולאסוף את מאגר MACS לתוך הצינור לשטוף (W).
- הסר את העל-טבעי.
- Resuspend גלולה ב 500 μl MACS מאגר.
- לטעון את השעיית התא 500 μl למסנן, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר MACS מאגר למסנן ולאסוף את השבר השלילי לתוך צינור התגובה שבר שלילי (-).
- לאחר מכן, הוסף 3 x 3 מ"ל של מאגר MACS לעמודה כדי לשטוף את התאים שאינם מאוגדים לעמודה
- לאחר אלה 9 מיליליטר הם דרך עמודת LS, להסיר את העמודה מן המעמד המגנטי ולהתקין אותו על גבי צינור התגובה שבר חיובי (+).
- טען במהירות 5 מ"ל של מאגר MACS בעמודת ה- LS והצב את הכוכנה בעמודת LS והקש עליה כלפי מטה עד שהמאגר כולו יעבור דרך העמודה.
- צנטריפוגה צינור התגובה המכיל את השבר החיובי במשך 5 דקות ב 300 x g.
- הסר את supernatant, resuspend ב 500 μl של מאגר MACS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
- ספור את הכמות הכוללת של תאים באמצעות התקן נפוץ לספירת תאים.
- הכנת השעיית תא מהשבר הממוין החיובי המכיל 2 x 105 תאים/μl במאגר MACS ולשמור על 4 °C (70 °F)
4. השתלה של MAC ממוין פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית של העכבר
- הקפד לקבל את כל הפתרונות הבאים מוכנים: 1 מיליליטר סטרילי PBS או HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 מיליליטר סטרילי deionized H2O, aliquots של שברי השעיית התא ב 4 מעלות צלזיוס.
- הרדמה של העכבר הבוגר(כלומר 2-4 חודשים) עם הזרקה תוך-אישית של medetomidine הידרוכלוריד (0.01 מ"ג /10 גרם משקל גוף), קטמין (0.75 מ"ג / 10 גרם משקל גוף). לאחר מכן לעשות זריקה תת עורית של Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) להקלה על הכאב.
- תרחיב את התלמידים עם ירידה של פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%.
- תקן את העכבר במחזיק ראש העכבר והנח תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- החל טיפה של ג'ל Visidic כדי למנוע ייבוש של העין.
- לעשות חור קטן בגבול בין סקלרה וקרנית (בהתאמה אורה serrata)באמצעות סטרילי 30 G 1/2 במחט.
- חותכים שקופית כיסוי משותפת לחתיכות קטנות (כ-5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות עט יהלום, מניחים את אחת החתיכות האלה על גבי הקרנית, ומאפשרים הדמיה ישירה של הרשתית.
- לשטוף את מזרק microliter מעוקר מספר פעמים עם מים deionized.
- לטעון את מזרק microliter עם 1 μl של השעיית התא, מחט ישירה משיקת דרך הלחמית וסקלרה ומניחים תחת שליטה חזותית במחצית האף של הרשתית.
- אגרוף בעדינות חור לתוך הרשתית עד להגיע לחלל subretinal, להזריק את המתלה התא לתוך החלל subretinal.
- שימו לב לניתוק השוורי של הרשתית, שאמורה להיות אחידה, המכסה כ -1/4 משטח הרשתית ללא דימום.
- משוך את המזרק בעדינות, אטמי חור הרשתית באופן אוטומטי.
- לשטוף את מזרק microliter מספר פעמים עם מים deionized.
- שחרר את העכבר ממחזיק הראש.
- הער את העכבר על ידי הזרקת אטיפמוזולה הידרוכלוריד להיפוך של אפקט הידרוכלוריד medetomidine.
- מניחים את העכבר לזמן התעוררות בתא כהה וחם (כ 25 °C (60 °F).
- ביומיים הבאים לאחר ההשתלה, Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם של משקל גוף) צריך להינתן על ידי הזרקה תת עורית בבוקר ואחר הצהריים להקלה על הכאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת להעריך את היכולת של רוד photoreceptors להשתלב ברשתית העכבר, קו כתב העכבר שימש, שבו GFP מונע על ידי רוכסן רשתית עצבית (Nrl, Nrl-GFP) מקדם11. Nrl הוא הסמן המוקדם ביותר של פוטורצפטורים מוט מתחיל את הביטוי שלה ב E12.5 לאורך כל הבגרות, המאפשר תיוג ספציפי של תאים פוטורצפטור מוט התורם.
PN 4 גורי NRL-GFP נערפו והעיניים היו חדורים. לאחר מכן, הרשתית בודדה ונותקו בשיטה שתוארה לעיל. לאחר מכן מוין השעיית התא שנוצרה באמצעות MACS מבוסס CD73 (איורים 1 ו- 2). לאחר מיון MAC, ניתחנו את ההעשרה שהושגה במהלך הליך זה.
כפי שמוצג באיור 3A, השעיית התא הראשונית (קלט) הכילה 30.4% תאים חיוביים ל-GFP, כלומר. מוט פוטורצפטורים. לאחר מיון MAC מבוסס CD73, העשרה של עד 86.9% בשבר CD73 חיובי (CD73+) נצפתה על ידי cytometry זרימה. בשבר CD73 שלילי (CD73-) רק 9.9% מכל התאים זוהו באופן חיובי עבור GFP (איור 3A). ההעשרה של תאים חיוביים NRL-GFP בעקבות MACS מבוסס CD73 הוא גם דמיינו לאחר ציפוי במבחנה (איור 3B).
לאחר מיון MAC, תאים תורמים בשבר CD73 חיובי סובבו למטה ו resuspended לריכוז הסופי של 200,000 תאים / μl. השעיית תאים זו שימשה גם להשתלה בחלל התת-קרקעי של רשתיות מארחות מסוג בר (איור 4). שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, הרשתית המארחת תוקנה, בודדה ונותחה. מספר תאים תורמים השתלבו בשכבה הגרעינית החיצונית של המארחים ורכשו את המורפולוגיה של פוטורצפטורים בוגרים עם לוקליזציה של גוף התא בשכבה הגרעינית החיצונית והיווצרות ספירולים סינפטיים ומקטעים פנימיים (איור 5). תמונות מפורטות פורסמו בעבר על ידי הקבוצה שלנו3,8 מראה תוצאה דומה עם תאים ממוינים FAC מושתל לארח רשתית על ידי קבוצות אחרות4,6,10. עקבי בכל המחקרים האלה הוא, כי התאים המושתלים להישאר באתר של הזרקה, מוגדר על ידי הרשתית המארחת מנותק שוורים, ולא נודדים משם. חלקם משתלבים ברשתית המארחת(כלומר בשכבה הגרעינית החיצונית), וחלקם נשארים בחלל התת-קרקעי3. בנוסף, הוכח, כי ההתפלגות של תאים תורמים באתר האינטגרציה תלויה בסוג מודל העכבר המשמש5. לא זוהו סימני דחיית מארח/השתלה חריפים בהשתלות בין עכברי C57BL/6J.
איור 1. הערכה הכוללת של השתלת subretinal של מבשרי פוטורצפטור מטוהרים MACS לתוך רשתית העכבר הבוגר. תאים תורמים של PN 4 Nrl-GFP גורים מבודדים, ואחריו CD73 מבוססי MAC מיון מושתל לתוך החלל התת-קרקעי של רשתית מארח העכבר. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 2. העשרה של קולטני פוטו-קולטנים הניתנים להשתלה על ידי MACS. ההשעיה התא שנוצר מכל הרשתיות שנאספו PN4 הוא דגירה עם נוגדנים נגד CD73 עכברוש ראשי ואחריו כביסה ודגרה עם נוגדנים נגד חולדות מצומדים עם microbeads. נוגדנים לא מאוגדים נשטפים. השעיית התא מועברת דרך עמודת LS המחוברת עם מעמד מגנטי. תאים המאוגדים בנוגדנים נשארים מחוברים לעמודה בזמן שהתאים הנותרים מרוממים ונאספים (שבר CD73 שלילי). לבסוף, עמודת ה- LS מוסרת מהמעמד המגנטי והתאים הנותרים מרוממים ונאספים (שבר CD73 חיובי). לחץ כאן כדי לצפות בסרט מלא.
איור 3. ניתוח של העשרת תאים חיובית Nrl-GFP לאחר מיון MAC מבוסס CD73. (A) לפני המיון, האוכלוסייה הראשונית של תאים תורמים הכילה 30.4% מהתאים החיוביים Nrl-GFP. לאחר מיון MAC, ניתן היה לזהות העשרה של תאים חיוביים של GFP בשבר CD73+ (86.9%) בעוד שהשבר CD73 הכיל כמויות נמוכות בלבד של תאי GFP+ (9.9%). (B) תמונה מייצגת המדגימה את התוצאה של מיון MAC מבוסס CD73 של תאי PN4 Nrl-GFP. מיליון תאים מכל שבר היו מצופים על כיסויים מצופים למין. התאים תוקנו 4 שעות לאחר ציפוי עם 4% PFA במשך 10 דקות. התאים היו מוכתמים DAPI (4',6-diamidino-2-פנילינדול, 1:20,000). העשרה משמעותית של תאים חיוביים GFP בשבר CD73+ נצפתה בהשוואה לשבר הקלט או לשבר CD73. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 4. הזרקת תת-קרקעי. ציור סכמטי של תהליך ההשתלה ברשתית העכבר הבוגרת. המחט מוכנסת דרך חור באורה סראטה, מנווט בחלל הזגוגי על ידי הימנעות מנגיעה בעדשה ומונחת ברשתית תחת שליטה חזותית. על ידי דחיפה עדינה, המחט הוא אגרוף דרך הרשתית והניח בחלל subretinal. בסופו של דבר, השעיית התא מוזרקת בזהירות תחת שליטה חזותית על ידי הערכת תהליך הניתוק.
איור 5. שילוב של תאי פוטורצפטור מושתלים. תמונה מייצגת המתארת MACS משולב מבוסס CD73 ממוין PN4 Nrl-GFP תאים בעקבות השתלה לתוך הרשתית של העכבר הבוגר. מבשרי פוטורצפטור מושתלים משתלבים כראוי בשכבה הגרעינית החיצונית (ONL) ויוצרים מורפולוגיה פוטורצפטורית בוגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלה תת-קרקעית של תאי מבשר פוטורצפטור מייצגת כלי אמין להשגת שילוב של תאים רגישים לאור אלה ברשתיות מארחות במספרים משמעותיים1,2. זה עשוי לאפשר הקמת טיפול בתא לטיפול במחלות ניווניות ברשתית בעתיד6. אוכלוסיית התורמים של תאים, מבודד כיום PN 4 רטינות, היא תערובת של סוגי תאים שונים, שממנו רק תאים מבשר photoreceptor לשלב לאחר הזרקת subretinal. באמצעות מיון MAC מבוסס CD73, ניתן להגדיל את שיעור הפוטורצפטורים בתוך המתלים של תאי התורם ל- ≈ 90% המאפשר שיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בערך ברשתיות מארחות מסוג בר בהשוואה לאוכלוסיית התאים הלא ממוינים8. בהשוואה cytometry זרימה, MACS יש את היתרון של הליך מיון מהיר וכי זה יכול להיות קל יחסית להחיל על תקני GMP. הטיהור של פוטורצפטורים להשתלה הוא עניין ספציפי לאור היתרונות האחרונים עבור הדור במבחנה של פוטורצפטורים מתאי גזע pluripotent12-14. תרבויות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מובחנים מורכבות מסוגי תאים מגוונים שהופכים את הזמינות של הליכי מיון ספציפיים תנאי הכרחי לשימושם העתידי בטיפולי השתלת תאים.
על פי הליך טיהור MACS, כמה נקודות ראויות לציון, הבטחת זרימת עבודה ללא הפרעות גדולות. ככל שמספר הרשתית גבוה יותר למיון, כך יש צורך בזמן רב יותר לעיכול שלהם. לאחר העיכול, במהלך הליך המיון, יש להימנע מצבור תאים. זה קורה רצוי לפני תוספת של הנוגדן המשני ובמהלך הדגירה שלה. במקרה זה, יש להסיר את הצבירה באופן מיידי באמצעות פיפטה. במהלך התרוממות רוח של מאגר MACS בעת איסוף שבר MACS שלילי, יש צורך בהחלט לא להוסיף יותר מ 3 מ"ל לעמודה. הלחץ של המאגר לעמודה יהיה גבוה מדי אם יתווסף מאגר גדול מ- 3 מ"ל. זה יפריע לכריכת הנוגדן לתאים ויוריד את יעילות המיון. בעת הסרת העמודה מהמעמד המגנטי כדי להתחיל לאסוף את השבר החיובי MACS, שלב זה צריך להיעשות במהירות. יש להוסיף את 5 מ"ל של מאגר MACS לעמודה מהר ככל האפשר. כמו כן, יש לשים את הצלילה וללחוץ במהירות עד שהמאגר כולו יעבור דרך העמודה. אין צורך לדאוג לגבי הלחץ המופעל. מאגר MACS הוא איזוטוני וניתן לגוון אותו. ניתן להשתמש במאגר FACS, מדיום תרבית תאים, PBS, EBSS או HBSS. עקרות של המאגר ניתן להשיג על ידי סינון דרך קרום מסנן 0.4 מיקרומטר.
לאחר העשרה על ידי MACS, השתלה מוצלחת של תאים תורמים לחלל subretinal ניתן להשיג על ידי שמירה על הנקודות הבאות בראש. מאז תאים photoreceptor נראה רגיש מאוד לטיפול ex vivo, זה לא מומלץ לשמור אותם על 4 מעלות צלזיוס יותר מהנדרש. המשך להשתלה מהר ככל האפשר. בעת החדרת מחט ההזרקה לתוך גלגל העין, חשוב להימנע מנגיעה בעדשה כמו מחט מתכת חדה יחסית עלולה להזיק העדשה וכתוצאה מכך אינדוקציה של uveitis הנגרמת על ידי העדשה. הצעד האחרון בדרך לחלל התת-קרקעי, חדירת הרשתית, הוא קריטי. מאז זה לא יכול לראות חזותית אם החלל subretinal הוא הגיע חשוב לפתח תחושה של הלחץ דוחף הנכון עמידות בפני רקמות. כדי לבדוק, אם ראש המחט ממוקם כראוי, נפח קטן יכול להיות מיושם ואת הניתוק של הרשתית בראש המחט צריך להיות שנצפה בזהירות. אם נוצרת ניתוק עגול ושורי ללא דימום, התנוחה נכונה ושאר הפתרון יכול להיות מיושם בזהירות. במהלך ההזרקה, המחט צריכה להישאר במקומה כדי למנוע נזק נוסף לרקמה. חור הרשתית שנוצר על ידי מחט ההזרקה יאטם מעצמו אם המחט נסוגה לאט. ההליך כולו צריך להיעשות בכמות מינימלית של זמן אפשרי כדי למנוע מתח נוסף ונזק לבעל החיים. במהלך ההשתלה, השעיית התא נוטה להתקבץ ולחסום את מזרק המיקרוליטר. אם זה קורה, דילול של השעיית התא באמצעות PBS סטרילי או HBSS מוצע. אפשרות נוספת להתגבר על בעיה זו היא להוסיף 1 μl של DNAse אני להשעיית התא, כדי להמיס גושי DNA מתאים מתים, אשר נוטים להדביק תאים חיים יחד.
פרוטוקול זה מוגבל למיון מגנטי של תאים. לכן, ניתן למיין את התאים עבור סמן אחד בלבד לכל סיבוב מיון. בהשוואה לציטומטריית זרימה, שבה ניתן למיין תאים באמצעות סמנים שונים (כולל תכונות פיזיולוגיות כמו גם סמני משטח תא שונים) בו זמנית, זהו חיסרון מרכזי של טכניקה זו. בכל פעם שיש צורך במיון סמנים שונים בחלון זמן קצר, ציטומטריית זרימה עשויה להיות הפתרון הטוב יותר. כמו כן, מיון עבור תכונות פלואורסצנטיות של תאים, כמו GFP מבוטא טרנסגנית או סמני תא חיים אחרים אינו אפשרי עם טכניקה זו. כיום הוא מוגבל לשימוש בנוגדנים משטח התא שניתן להצדיע עם חרוזים מגנטיים. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות קנה מידה על סמך הציוד הטכני המשמש.
מאז Miltenyi Biotec היא כיום הספקית היחידה של כלי מיון תאים מגנטיים, אין חלופה זמינה עד כה. עבור דיסוציאציה של תאים, אנזימים אחרים מאשר פפאין(כלומר טריפסין) ניתן להשתמש. שימו לב, המעבדה שלנו השיגה את התוצאות הטובות ביותר עם פפאין, שכן נראה שזה אנזים הדיסוציאציה העדין ביותר בידינו. חלון הזמן של עיכול פפאין (30-60 דקות) משתנה. בתקופה זו הושג עיכול אופטימלי במעבדה שלנו. ייתכן שיהיה צורך בזמן דגירה קצר יותר או ארוך יותר בהתאם לגודל המדגם, איכות הדגימה והאנזים המשמשים. מוצעת בדיקה פרטנית.
בהתחשב בכך MACS צעד אחד אינו מגיע לרמות טוהר גבוהות כמו cytometry זרימה, יישום נוסף אפשרי של טכניקה זו עשוי להיות מיון שלילי של תאים מזיקים לא רצויים ופוטנציאליים. שם, חלק התא חיובי עבור סמן משטח תא נתון אך לא מעניין ניתן למיין, משאיר את שבר העניין מבודד בזרימה דרך. זה יכול להיעשות מראש או לאחר שלב מיון חיובי ומאפשר אפליה נוספת של תאים באמצעות סמני משטח תא שונים, כמו גם הסרת תאים לא רצויים, כמו תאי שכבת הזנה או תאים מובחנים מתרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים עם הסיכון הגידול הפוטנציאלי שלהם. לכן, MACS עשוי להיות מתאים לטיהור של פוטורצפטורים מתרביות תאים ES או iPS ביישומים טיפוליים עתידיים אפשריים כפי שהוא מייצג טיפול עדין, מהיר ופשוט לטיהור כמויות גבוהות של תאים תרבותיים. MACS יכול להיות מיושם בקלות על תנאי GMP מאז הפרטים של צעדי מיון, כלומר מכניקה, נוזלים ונהלים מופחתים בהשוואה cytometry זרימה. ראוי לציין, כי MACS כבר משמש באופן שגרתי בניסויים קליניים להעשרת תאים מדם או מח עצם. מעניין, MACS יכול להיות מיושם אפילו על תאים כאשר אין סמן משטח התא מתאים קיים, על ידי החדרה גנטית סמן פני השטח כדי להפוך תאים "מוכשרים" עבור מיון תא מגנטי הבאים שלבים15.
לסיכום, MACS מייצג כלי אמין ומהיר להעשרת תאי מבשר פוטורצפטור באמצעות סמני משטח תאים למחקרי השתלה. בנוסף, זוהי שיטה הניתנת להעסקה בקלות עבור יישומים קליניים עתידיים הדורשים תנאי GMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו אוהבים להודות לאנאנד סווארופ על שסיפק לעכברי NRL-GFP, יוכן האס על התמיכה הטכנית, וסינדי בוהם ואמלי לסמן על גידול בעלי חיים.
עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - מרכז טיפולים רגנרטיביים דרזדן, תוכנית מענק זרע CRTD, SFB 655, ואת E.V ProRetina. קרן, תוכנית הבוגרים DIGS-BB דרזדן, ואת Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
