Summary
Plasticité neuronale est une caractéristique de plus en plus reconnue, mais mal compris de la gastro-intestinal (GI). Ici, dans l'exemple de troubles pancréatiques humaines, nous présentons un dosage in vitro de la plasticité synaptique pour l'étude de la plasticité neuronale dans le tractus gastro-intestinal à la fois au niveau morphologique et fonctionnelle.
Abstract
Neuroplasticité est une caractéristique inhérente du système et gastro-intestinal (GI) innervation nerveux entérique dans des conditions pathologiques. Cependant, le rôle physiopathologique de la neuroplasticité dans les troubles gastro-intestinaux reste inconnue. Modèles expérimentaux nouveaux qui permettent la simulation et la modulation de GI neuroplasticité peuvent permettre une meilleure appréciation de la contribution de la neuroplasticité en particulier les maladies gastro-intestinales telles que le cancer du pancréas (CaP) et pancréatite chronique (PC). Ici, nous présentons un protocole pour la simulation de la neuroplasticité du pancréas dans des conditions in vitro utilisant des nouveau-nés dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) et plexus myentérique (MP) neurones. Cette double approche permet non seulement neurone suivi de deux neuroplasticité organe intrinsèque et extrinsèque, mais représente également un outil précieux pour évaluer la morphologie des neurones et des cellules gliales et l'électrophysiologie. De plus, il permet la modulation fonctionnelle des matières microenvironnement fournis pour l'étude de leur impact sur la neuroplasticité. Une fois établi, le dosage de la neuroplasticité porte présente le potentiel d'être applicable à l'étude de la plasticité synaptique dans un organe digestif.
Introduction
Altérations de la gastro-intestinale (GI) morphologie de nerf et de la densité ont attiré l'attention des gastro-entérologues et les médecins depuis longtemps, mais leur pertinence pour la physiopathologie de maladies gastro-intestinales reste inconnue 1-3. En effet, plusieurs troubles digestifs très courantes telles que la gastrite, oesophagite par reflux, la colite, la diverticulite, l'appendicite et sont associés à une augmentation de densité d'innervation dans les zones de tissu enflammés 1. Cependant, aucune véritable attention a jusqu'ici été accordée aux mécanismes et la signification de la neuroplasticité dans le tractus gastro-intestinal. Ne nerfs GI morphologiquement modifiées diffèrent des nerfs GI normales, c'est à dire l'état normal du système nerveux entérique, en termes de leur fonction? Quelles sont les implications de contenu modifié neuropeptide / neurotransmetteur dans les nerfs entériques plastique? Est-ce que la neuroplasticité périphérique n'entraîne toujours signalisation modifié pour le système nerveux central? Et où sont les projections centrales de extri plastiqueNSIC voies gastro-neurones? Une longue série de ces questions clés peut être facilement généré lors de la recherche à la rareté de nos connaissances sur les aspects fonctionnels de la GI neuroplasticité.
L'étude de GI neuroplasticité au niveau fonctionnel nécessite des modèles expérimentaux valides, reproductibles et encore facilement applicables. Dans l'ère de la popularité et l'acceptation de modèles génétiquement modifiés de souris conditionnelles (GECoMM), comme dans les milieux in vivo portent le potentiel pour élucider facettes jusque-là inconnues de GI neuroplasticité dans un mode réaliste 1. Cependant, la conception et la production de GECoMM reste coûteuse, main-d'œuvre et, surtout, beaucoup de temps. De plus, ils nécessitent la sélection a priori de la cible à condition modulée chez la souris génétiquement modifiée (par exemple, de la surexpression transgénique de facteur de croissance nerveuse / NGF dans les cellules épithéliales intestinales). Ainsi, pour le DESign d'un GECoMM succès, les chercheurs ont besoin de certains indicateurs (par exemple, les données expérimentales précédentes) d'une cible valable, à savoir que la molécule d'intérêt (ici NGF) peut au moins s'attendre à exercer certains effets biologiques pertinents sur les nerfs de GI.
De tels indicateurs peuvent facilement être obtenus à partir adéquate des modèles in vitro, dans lequel les sous-types de cellules isolées à partir du micro-environnement complexe d'un système in vivo peuvent être co-cultivées de façon sélective d'une manière hétérotypique 7.4. La modulation de cibles moléculaires dans un tel contexte de culture hétérotypique est en moyenne techniquement moins lourde, plus rapide, et peut donc aider à la pré-filtrage des cibles intéressantes pour la vérification dans les études in vivo.
Récemment, nous avons présenté un test in vitro de la plasticité synaptique dans lequel a été conçu pour simuler la densité neuronale accrue et une hypertrophie de ne intrapancréatiquerves dans le cancer pancréatique humaine (cancer de la prostate) et pancréatite chronique (PC) tissus. Ici, les neurones dérivés de nouveau-né dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) ou plexus myentérique (MP) ont été exposées à des extraits de tissus de cancer de la prostate subi une résection chirurgicale ou CP tissus spécimens et comparées à celles cultivées dans du pancréas humain normal (NP) des extraits de tissu 5. Au lieu d'extraits de tissus, on peut aussi utiliser surnageants de lignées cellulaires pour étudier l'impact de différents types de cellules sélectionnées sur la neuroplasticité. Lorsqu'il est combiné avec une mesure morphométrique normalisé, le dosage de la neuroplasticité présentée permet une évaluation valide et reproductible de la plasticité neuronale en réponse à différents micro-environnements du pancréas. En particulier, elle permet la simulation d'une) neuroplasticité morphologique, c'est à dire l'évolution de la croissance des neurites, motif de ramification et de la taille des neurones, et 2) la plasticité synaptique fonctionnelle, c'est à dire des altérations de l'excitabilité des neurones périphériques. En outre, non seulement périphérique (c.-à- (par exemple la moelle DRG ou second ordre) des neurones peut être inclus dans le présent dosage pour évaluer leur réaction morphologique et fonctionnelle à des contenus différents de tissu gastro-intestinal. Dans le tutoriel vidéo présente, nous démontrons le protocole technique pour la réalisation de ce test et de discuter de ses avantages et ses faiblesses. En outre, nous attirons l'attention sur l'applicabilité de la notion de base de cette analyse à l'étude de la plasticité synaptique dans n'importe quel organe de GI.
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Protocol
Tous les animaux des procédures expérimentales dans le protocole suivent les directives de protection des animaux de la Technische Universität München, Allemagne.
1. Médias / Préparation Extrait
- homogénéisation tissulaire
La qualité de l'homogénéisation du tissu est essentielle à la détection ultérieure d'altérations neuroplastiques dans les neurones en culture. Ici, il est recommandé un homogénéisateur qui permet la dissociation des tissus sans augmentation importante de la température du tissu.- Transférer 5 mm x 5 mm x 5 mm cubes de tissu pancréatique directement à partir de -80 ° C à l'azote liquide et le placer dans une phase solide dans la homogenator tissulaire. Le homogenator idéal serait de dissocier le tissu assez vite, sans lui permettre de défiger.
- Immédiatement après la dissociation, de remettre en suspension le, homogénat de poudre solide analogue à de 300 à 500 pi de 0,1 x tampon phosphate salin (PBS). Ici, ne pas utiliser de tampon de lyse (comme RIPA) car cela peut lyser les neurones.
- Centrifuger les homogénats pendant au moins 15 min à la vitesse maximale du centrifugeuse de paillasse (par exemple de 21 130 xg). Recueillir le surnageant clair qui représente l'extrait de tissu.
- Les surnageants de la lignée cellulaire
- Laisser les cellules d'intérêt atteignent au moins 70 à 80% de confluence dans du milieu de croissance normal.
- Habituellement, ces médias contiennent des composants sériques et peuvent exercer des effets incontrôlables sur la croissance neuronale. Par conséquent, après avoir atteint la densité cellulaire souhaitée, lavez-vous les cellules au moins 3x avec le grade de culture cellulaire PBS et les placer dans un milieu sans sérum (SFM) pour un maximum de 48 heures.
Note: Ici, considèrent que certaines cellules (comme les cellules étoilées du pancréas) peuvent avoir besoin de sérum dans leur milieu de croissance afin de maintenir leur état normal et la structure. Dans ce cas, effectuer des dilutions de sérum en série dans le milieu de la cellule d'intérêt afin de trouver le contenu de sérum plus bas possible nécessaire pour foncti cellulaire intacten. - Mesurer la concentration en protéines de l'homogénat de tissu ou de surnageants de cellules par l'intermédiaire de dosage de protéine de Bradford. Bien que ces valeurs varient en fonction du type de tissu et de cellule, pour les extraits de tissus pancréatiques, on pourrait s'attendre à une plage de concentration comprise entre 5 à 12 pg / pl, et de surnageants de lignées cellulaires entre 8.3 ug / ul.
2. Aliquotes Extraits et surnageants cellulaires
En fonction de la concentration pour être utilisée dans le dosage, la concentration finale de l'extrait ou du surnageant dans le milieu neuronal devrait être de 100 pg / ml 5,8.
Remarque: Pour un essai avec des neurones en croissance dans 500 ul de milieu dans chaque puits d'une plaque à 24 puits, on a besoin de 50 pg de protéine de l'extrait ou du surnageant par puits. A une concentration typique de l'extrait de l'ordre de 10 pg / pl, il faudrait 5 ul de l'extrait / surnageant de chaque puits. Dans tous les Réglagesg effectuée en trois exemplaires, cela correspondrait à 15 ul d'extrait / surnageant. Pour les types de tissus ou de cellules différentes, effectuer des dilutions successives de l'extrait final ou de la concentration de surnageant et de comparer les effets neurotrophiques observées entre les différentes concentrations d'extrait / surnageant.
3. Isolement des neurones
Une fois la collecte extrait / surnageant est terminée, continuer avec l'isolement des neurones.
- Pour les neurones de DRG, de recueillir le col de l'utérus à lombaire DRG de rats nouveau-nés entre le jour postnatal (P) 2-12 après la décapitation et la dissection stéréomicroscopique de DRG (figure 1A). Afin d'avoir les neurones de DRG suffisantes pour une plaque de 24 puits, recueillir toutes cervicale lombaire DRG de rat nouveau-né un (égalant 52 DRG) par plaque.
- Coupez le périphérique (neurones) et les projections centrales (racines) de DRG au moyen d'microciseaux.
Laissant les projections en place empêche trituration et augmente til risque de contamination de la culture par les fibroblastes.
- Coupez le périphérique (neurones) et les projections centrales (racines) de DRG au moyen d'microciseaux.
- Pour les neurones MP, couper le mésentère de l'intestin grêle et manuellement et avec précaution dépouiller la couche séromusculaire de l'intestin grêle (pour un protocole détaillé sur MP isolement, reportez-vous à Schäfer et al. 9, figure 1B). Pour le député, recueillir le plexus de deux rats par 24 plaques à puits.
Remarque: Essayez d'être aussi doux que possible afin d'éviter les déchirures dans la couche séromusculaire car ils entravent sa séparation réussie de l'intestin grêle. - Recueillir le DRG et séromusculaire couche dans un milieu essentiel minimal glacée (MEM) alimenté avec de la gentamicine (20 mg dans du milieu 500 ml) et de métronidazole (2,5 mg dans 500 ml de milieu).
- Après la collecte de DRG, les incuber dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) alimentée avec de la collagénase de type II de 20 à 30 min. Pour le député isolement, incuber dans la collagénase de type entre 1-3 heures, en fonction de l'âgede l'animal (Figure 1C).
- Pour le député, de recueillir les pièces en forme de filet MP sous binoculaire et transfert à l'glacée MEM.
- Puis triturer le DRG et MP par seringues avec la diminution de diamètre.
Remarque: la trituration excessive peut détruire les neurones, mais moins les cellules gliales. - Une fois le milieu contenant le DRG ou MP est devenu nuageux, centrifuger la suspension à 93,9 g pendant 5 min, jeter le milieu et remettre en suspension dans un milieu Neurobasal (complété avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM L-glutamine et 2% de B-27).
- Compter le nombre total de cellules (à savoir les neurones et les cellules gliales) au moyen d'un hémocytomètre.
Note: Le nombre de cellules nécessaires dépend du paramètre de mesure. Pour la quantification de la densité des neurites, on a besoin de cultures plus denses, et donc un plus grand nombre de cellules que pour la mesure de la croissance des neurites, la taille perikaryonalet patron de ramification des neurones individuels. Pour les mesures de densité de neurites, utiliser par exemple 10 000 cellules (neurones + gliales) / puits ou 1500 neurones / puits. Pour morphométrie sur les neurones individuels, bref (1 minute-long) trypsination des cellules et l'ensemencement de 2500 cellules / puits ou 400 neurones / bien est recommandée. Le rendement typique de cellules obtenues à partir d'un rat est d'environ 300,000-500,000 cellules. - Ensemencer les cellules sur des lamelles de 13 mm qui ont été revêtus de la nuit avant et le haut des puits avec un milieu Neurobasal (supplémenté avec 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 0,5 mM de L-glutamine et 2% B-27) (Figure 1D).
Note: L'utilisation de poly-D-lysine (40 mg / m 2) ou de l'ornithine et la couverture des bordereaux de laminine (1 mg / ml chacun) enduit. Cellules attachent à la poly-D-lysine extrêmement rapide, ce qui rend approprié pour des expériences dans lesquelles de nombreuses cellules sont nécessaires (à savoir les mesures de densité de neurites). Attachement à la laminine est un généralce plus faible, mais la laminine est un ardent promoteur de la croissance des neurites. Par conséquent, pour les mesures sur ramification neuronale et la longueur des neurites, préférer ornithine / laminine-revêtement. - Autoriser les cellules attachent aux puits pendant la nuit. Le jour suivant, la préparation des milieux d'extrait supplémenté (à une concentration finale d'extrait / surnageant de 100 ug / ml).
- Aspirer le milieu d'ensemencement, et d'effectuer un lavage en option, très doux avec du PBS, puis la pipette lentement le répertoire / media surnageant additionné extrait (figure 1E).
- Laissez les cellules se développent pendant 48 heures. Aspirer les médias et fixer dans du paraformaldéhyde 4% pour immunomarquage (figure 1F).
- Effectuer une double coloration par immunofluorescence en utilisant spécifiques des neurones (par exemple bêta-tubuline III) et les cellules gliales spécifiques (par exemple des cellules gliales fibriallary protéine acide / GFAP) marqueurs (figure 1G).
- Pour morphométrie, utiliser un microscope optique inversé équipé d'une caméra CCD en combinaison with logiciel automatisé qui permet de mesurer la densité des neurites (voir le tableau).
- La densité des neurites des cultures de neurones est mesurée sur 4-5 microphotographies représentatives à 200x grossissement de quatre régions différentes de la plus dense croissance sur chaque lamelle couvre-objet en superposant un 50 um x 50 grille um et en comptant la densité des fibres par mètre carré mesurée dans les fibres qui se croisent. La croissance des neurites, le nombre de branches par neurone signifie, la durée moyenne de la branche et de la taille perikaryonal peuvent être mesurées à partir choisis au hasard 30 neurones solitaires de chaque lamelle en marquant les neurites et péricaryons (figure 1H).
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Representative Results
Neuroplasticité morphologique
Dans l'intervalle indiqué par âge de rats nouveau-nés (P2-12) et les densités de semis, les neurones MP et DRG construisent déjà des réseaux neuronaux denses après 48 heures (figure 2A). Comparaison de la densité des neurites entre les neurones cultivés en PCa, CP, et des extraits NP révèle une plus grande densité des neurites des neurones DRG en PCa ou extraits de CP dans des extraits de NP (Figure 2A) 5. Nous préférons particulièrement neurones MP pour les mesures sur les neurones individuels, puisque les neurones MP ont tendance à dissocier plus facilement de entourant les cellules gliales que les neurones DRG. Ici, les neurones MP cultivées dans des extraits de PCa ou CP construire également des neurites plus longs et présentent un motif de ramification plus complexe que les neurones MP croissante dans NP-extrait contenant le milieu (figure 2B) 5. L'absence de cette différence de morphologie neuronale induite par NP, CP, et des extraits de cancer de la prostate indique un problème technique dans l'unéssayé. Dans la plupart des cas, cela peut être dû à 1) la mauvaise qualité de l'extrait préparé en raison de temps de traitement ou 2) en raison de dommages aux neurones qui se sont produits au cours du processus d'isolement.
Des études fonctionnelles
Le dosage de la neuroplasticité porte assez grande sensibilité pour détecter des altérations induites par la présence ou l'absence de certaines molécules cibles d'intérêt dans les extraits ou des surnageants complétées. Par exemple, le blocage de la Artemin facteur ou nerf facteur neurotrophique croissance à partir de cellules PCa (PCC) des surnageants par l'ajout d'anticorps bloquants spécifiques au NGF ou par épuisement induite Dynabead-des résultats des Artemin dans l'atténuation de la formation du réseau neuronal (figure 2C) 10. Dans une étude récente, nous avons pu montrer un effet très similaire à la contribution du facteur neurotrophique Neurturin à la neuroplasticité dans CP en comparaison simultanée avec d'autres facteurs neurotrophiques tels que le NGF, des cellules gliales en ligne-Derived facteur neurotrophique (GDNF) ou le facteur transformant de croissance bêta (TGF-bêta) 11.
Glie
La même approche peut également être appliquée pour évaluer la réaction des cellules gliales satellites DRG-associé ou cellules gliales entériques au contenu microenvironnement pancréatiques. En effet, l'un des effets les plus puissants d'extraits de tissus CaP sur la glie DRG ou MP-associé est important augmentation de la croissance des cellules gliales (Figure 3) 5. En outre, cet effet est plus prononcé dans CaP qu'en CP. Ici, on doit considérer que la prolifération des cellules gliales ne devrait pas être jugée d'après les chiffres de la glie absolus, mais plutôt sur la proportion relative des cellules gliales aux neurones (cellules gliales-neurone-index) 5. Ceci est particulièrement important à prendre en considération puisque le nombre de cellules de la glie dans ces cultures est plus difficile à contrôler en raison de la puissance de la prolifération des cellules gliales par opposition aux neurones.
Figure 1. Protocole Schéma de l'essai in vitro de la plasticité synaptique. La présente analyse fait usage du nouveau-né dorsale de rat ganglions de la racine (DRG) et le plexus myentérique (MP) de neurones pour étudier l'impact des extraits de tissus pancréatiques ou de surnageants de cellules sur la morphologie des neurones et des cellules gliales. DRG sont collectées après laminectomie antérieure et MP-couche contenant séromusculaire après résection et de décapage mécanique de l'intestin grêle (A, B). Après la collagénase de type II digestion, les neurones sont ensemencées dans la densité nécessaire (voir le texte pour plus de détails) annonce cultivé pendant 24 heures (C, D). Ensuite, le pancréas fraîchement préparé (ou à partir de n'importe quel organe de GI d'intérêt) et des extraits de surnageants de cellules sont ajoutés dans le milieu de croissance des neurones à des concentrations définies précédemment (E).Après 48 h, les cultures sont fixées dans du paraformaldéhyde 4% et à double immunocoloration contre des marqueurs neuronaux et gliaux (F, G). La morphologie neuronale, y compris la densité des neurites, modèle de ramification de neurones et la taille perikaryonal sont mesurés au moyen d'un protocole logiciel standard (H). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Neuroplasticité pancréatique induite par le cancer pancréatique humaine (cancer de la prostate) et pancréatite chronique (PC). Extraits de tissus pancréatiques humaines chirurgicalement dérivées de pancréas normal (NP), CP ou tissus CaP induire des différences importantes dans la densité des neurites de DRG ne urons (A) et dans le modèle de ramification neuronale de neurones MP (B). Ici, des extraits de tissus APC et CP exercent un effet neurotrophique en vue sur les neurones DRG et MP. Semblable à des extraits de tissus, aussi les surnageants des types cellulaires particuliers (cellules cancéreuses pancréatiques ici / PCC) également augmenter remarquablement la densité des neurites des neurones de DRG (C). Cette augmentation, toutefois, est réversible lorsque des facteurs neurotrophiques sélectionnés tels que artémine (Artn) ou facteur de croissance des nerfs (NGF) sont épuisées ou bloquées avec ces surnageants. Tous les neurones immunocolorées contre la bêta-tubuline III-. Toutes les images à un grossissement de 100X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Réaction gliale au contenu microenvironnement pancréatiques. Extraits de tissus pancréatiques de cancer de la prostate ou de tissus de CP ont non seulement un effet neurotrophique, mais aussi d'améliorer la croissance des cellules gliales et la numération des cellules gliales dans les cultures DRG ou MP. cellules gliales immunocolorées contre le marqueur de cellules gliales protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Toutes les images à 200X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le présent protocole est destiné à illustrer la méthodologie derrière le dosage de la neuroplasticité du pancréas in vitro qui a été récemment développée par notre groupe pour étudier les mécanismes de la plasticité synaptique dans CaP et CP 5. Le protocole implique une procédure de trois jours qui peut facilement être appliqué une fois l'artiste a acquis une expérience suffisante dans l'isolement et la culture de neurones DRG et MP. En outre, il représente un outil précieux pour l'étude de la réaction concomitante de cellules gliales entériques et DRG associés à des composants micro-environnement du pancréas.
À notre avis, l'une des caractéristiques les plus intéressantes de ce test est sa capacité à détecter et à simuler les changements qui se produisent pendant cancer de la prostate et du CP (c.-à-germination de neurones et hypertrophie) dans un cadre simplifié in vitro. En effet, l'application des extraits de tissus ou des surnageants de cellules entraîne des changements dans la morphologie neuronale which peuvent être détectées avec une sensibilité suffisante par analyse morphométrique systématique. Récemment, nous avons pu également démontrer que ce dosage est également sensible pour détecter les différences de potentiel neurotrophique de plusieurs entités du cancer en comparaison simultanée: Lorsque les attributs neurotrophiques de lignées cellulaires PCa ont été comparées à des lignées cellulaires de cancers colorectaux, les lignées cellulaires PCa induit significativement une plus grande densité de neurites entre neurones DRG que les lignes d'un cancer colorectal 8. Même dans la comparaison des rectale contre des lignées de cellules de cancer du colon, des lignées cellulaires de cancer du côlon étaient inférieurs à des cellules de cancer du rectum en termes de leur potentiel neuroplastic 8.
Un des principaux avantages de ce test est sa facilité d'accès pour non seulement morphométrique, mais aussi des analyses électrophysiologiques. Contrairement à dans les neurones in situ dans des préparations de tranche, les enregistrements de neurones dans notre test dans des milieux définis ou à la uneBSENCE / sur-présence de facteurs définis sont pas techniquement exigeant et peut fournir des informations précieuses sur le rôle des molécules sélectionnées dans ces micro-environnements sur l'activité neuronale.
Certes, l'analyse présentée ne doit pas être considéré pour être uniquement limité à l'étude des questions liées à la neuroplasticité du pancréas. Neuroplasticité est une caractéristique importante de l'ensemble du tractus gastro-intestinal dans des conditions pathologiques, comme les neuropathies entériques inflammatoires 1-3. Toutes ces conditions ont été signalés à être associée à des changements dans la morphologie et l'innervation de l'activité neuronale altérée 1-3. Par conséquent, il est envisageable de remplacer les extraits de tissus pancréatiques ou des lignées cellulaires par ceux qui sont dérivés à partir des tissus correspondants et d'étudier leurs effets spécifiques sur les neurones et les cellules gliales qui l'accompagne. Nos analyses récentes sur la comparaison des tissus du cancer du pancréas et le cancer colorectal appuient cette notion 8. Cependant, il est également plausible pour supposante que les composants de différents micro-environnements de tissus peuvent pas induire des altérations comme sensibles et représentatifs que nous observons régulièrement dans les composants des tissus pancréatiques. Par conséquent, nous recommandons l'évaluation approfondie de la morphologie précédente neuronale induite par les tissus «positifs» de contrôle (c.-à-tissus présentant une hypertrophie de neurones par exemple histologiquement prouvé) par rapport à des tissus "négatives" de contrôle (c'est à dire sans preuve histologique de l'hypertrophie de neurones).
Nos analyses antérieures concernant la réaction de la glie dans cet essai ont été limitées à la détermination de la numération des cellules gliales dans les différents micro-environnements du pancréas. cellules gliales possèdent une importance nouvelle en neurobiologie depuis la reconnaissance de leur potentiel neurogène et un intérêt accru dans les courants de calcium long membrane gliale 12. Par conséquent, les cellules gliales dans cet essai sont également facilement accessibles à d'autres analyses fonctionnellespar de nouvelles approches. Cependant, ces approches novatrices supplémentaires doivent validation étendue précédente avant leur application à d'autres études.
Comme n'importe quel autre essai expérimental, aussi le test de la neuroplasticité présentée porte une certaine comparabilité limitée des échantillons de tissus humains provenant de différents patients subissant une chirurgie. Il est impératif pour ces tissus qui découlent de mêmes régions de tissus (par exemple la tête du pancréas, de la masse de la tumeur principale) pour des analyses fiables 1. En outre, même lorsque cette condition est remplie, d'autres différences dans le tissu ou la biologie des tumeurs ne peuvent être exclues compte tenu de la grande variation de la configuration de la réponse biologique d'individus différents 1. Pour contourner ces différences de tissus, nous vous recommandons la performance du test avec les tissus obtenus à partir autant de patients que possible, c'est à dire avec au moins 5 - 10 patients différents par entité.
Comme un aspect technique clé, nous voudrions attirer l'attention sur le rôle des substances de revêtement sur la croissance neuronale. Comme l'a également mentionné ci-dessus, nous préférons poly-D-lysine pour les mesures sur la densité des neurites, et le revêtement ornithine / laminine pour ceux sur le modèle neuronal individuel ramification / excroissance. En nos mains, tandis que la mesure de l'excroissance neuronale peut également être effectuée sur-D-lysine recouvert de poly surfaces, on trouve que cette approche a tendance à diminuer la sensibilité de l'essai pour les différences réelles. Par conséquent, les chercheurs appliquent ce dosage doivent assurer l'utilisation du matériau de revêtement optimal pour leur question d'intérêt.
En résumé, nous pensons que le dosage de la neuroplasticité présenté représente un outil précieux pour obtenir des informations rapides et reproductibles sur la neuro-morphologie et neuro-fonction dans les différents micro-environnements de tissus, comme le montre l'exemple detissu pancréatique. La détection sensible des différences de neuro-morphologie induite par différentes teneurs en tissu pancréatique souligne la reproductibilité in vitro de la neuroplasticité du pancréas en cancer de la prostate humaine et CP. Les efforts futurs viseront à optimiser le dépistage du preassay de surnageants appliquées et extraits d'atteindre les médias le mieux défini pour l'étude de la GI-maladie associé à la neuroplasticité.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrentes et aucune divulgation financière.
Acknowledgments
Tous les auteurs ont contribué à la création et la validation de l'essai présenté et le projet du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
