Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.
Generación de una población homogénea y abundante de células del músculo esquelético a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) es un requisito para las terapias basadas en células y por una "enfermedad en un plato de" modelo de las enfermedades neuromusculares humanos. Obstáculos importantes, como la baja abundancia y heterogeneidad de la población de interés, así como la falta de protocolos para la formación de estructuras contráctiles tridimensionales, han limitado las aplicaciones de las células madre para trastornos neuromusculares. Hemos diseñado un protocolo que supera estos límites por introducción ectópica de factores definidos en hESCs – el factor de MyoD determinación muscular y SWI / SNF remodelación de la cromatina BAF60C componente complejo – que son capaces de reprogramar hESCs en las células del músculo esquelético. A continuación se describe el protocolo establecido para generar mioblastos hESC-derivados y promover su agrupación en estructuras miniaturizadas tridimensionales (myospheres) que imitan funcionalmente músculos esqueléticos miniaturizados 7 </sup>.
Debido a su capacidad única de auto-renovación, manteniendo la pluripotencia, las células madre embrionarias humanas (hESCs) se consideran un recurso muy valioso en la medicina regenerativa. Generación de células madre de repoblación mediada de músculos enfermos y células hESC-o madre pluripotentes inducidas (IPSC) derivada de los músculos esqueléticos para el modelado de la enfermedad in vitro son objetivos principales de los estudios dirigidos a la identificación de tratamientos y elucidar la patogénesis de muchas enfermedades neuromusculares. Sin embargo, estos estudios han sido cuestionados por la resistencia de hESCs para convertir a las células musculares esqueléticas y por la escasez de información sobre la regulación molecular de células madre-compromiso hacia miogenia esquelético. De hecho, los intentos previos para generar células progenitoras de músculo esquelético de hESCs revelaron que sólo el cuerpo embrioide progenie (EB) o derivados de células mesenquimales son competentes para activar miogenia esquelético siguiente expresión ectópica de activadores de la transcripción (por ejemplo,Pax3 o Myf5) 1-3 o por la exposición a condiciones de cultivo específicas 4-5.
Hemos demostrado anteriormente que el componente SWI / SNF, BAF60C (codificada por SMARCD3), es un componente esencial de la maquinaria transcripcional que permite la activación MyoD mediada de loci muscular específica 6. Recientemente hemos descubierto que la ausencia selectiva de BAF60C confiere a hESCs la resistencia a la activación mediada por MyoD de la miogénesis esquelético 7 que se observa lo contrario en BAF60C expresando células somáticas 8-10, un proceso comúnmente referido como conversión miogénica. La expresión forzada de BAF60C permite MyoD para activar directamente miogenia esquelético en hESCs, de las condiciones específicas de cultivo, con BAF60C y MyoD imponer una firma epigenética que compromete hESCs hacia el linaje miogénico 7. Es de destacar que el análisis proteómico anterior reveló la ausencia selectiva de BAF60C, entre los componentes de SWI / SNF, en los CES 11. Se utilizó este conocimiento para imponer un compromiso epigenética de hESCs en el linaje miogénico, que conduce a la generación de una población homogénea de mioblastos esqueléticos que podrían ser agregados para formar contráctil tridimensional estructuras (myospheres) que los músculos esqueléticos miniaturizados funcionalmente imitan 7. De hecho, nuestro método de generación de los progenitores del músculo esquelético de hESCs depende del compromiso epigenética de hESCs al linaje miogénico, que es fenotípicamente latente hasta que las células están expuestas a las señales de diferenciación, tales como células la agregación y la cultura en medio de diferenciación (ver protocolo específico). Esta estrategia permite la expansión de una población homogénea de hESCs que se epigenéticamente comprometida con el linaje del músculo esquelético y adecuado para la formación de myospheres contráctiles tridimensionales que recapitular histológico y propiedades funcionales de esqueléticomúsculos. Los myospheres proporcionan la primera evidencia de los músculos miniaturizados explotables para una "enfermedad en un plato de" modelo de las enfermedades musculares. Cuando generada a partir de derivados de pacientes CMPI, estos myospheres tienen el potencial para dilucidar preguntas de desarrollo de muchos años y la patogénesis de enfermedades raras, además de ofrecer el tremendo potencial como herramienta de cribado de alto rendimiento de compuestos terapéuticos. También tomamos nota de que una lectura inmediata de myosphere análisis podría ser proporcionada por inmunohistoquímica en secciones, como se describe en el protocolo JoVE por Gomes et al. 12
El protocolo propuesto aquí se describe cómo generar agrupaciones tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres) directamente desde hESCs. La estrategia propuesta tiene el potencial sin precedentes y extraordinaria para producir las mini músculos en suspensión que pueden ser adecuados como una "enfermedad en un plato de" modelo para los ensayos de cribado y estudios de desarrollo. Por otra parte, el método para generar myospheres de hESCs es sencillo y no requiere ningún paso de FACS de clasificación durante la diferenciación, que típicamente tiene un impacto negativo en el rendimiento de células recuperadas. Además, un procedimiento de clasificación durante la diferenciación podría interferir con la agregación, ya que implica una disociación de la JE en células individuales.
El método propuesto se basa en la reprogramación epigenética de hESCs con factores específicos, MyoD y BaAF60C, que no se expresan en las células madre embrionarias pluripotentes. MyoD y BAF60C proporcionan el "núcleo" de proteínas th complejoen marcas de los loci genómico a partir de la cual la transcripción procede a activar el programa miogénica esquelético. Los dos factores se entregan a las células por medio de las infecciones de lentivirus y por lo tanto es crítico para obtener una alta eficacia de la infección de ambos factores en todas las células. Esto se puede lograr mediante el uso de virus de alto título o virus dotados de marcadores de selección. Condiciones de cultivo también juegan un papel importante en la optimización de la extensión de la diferenciación miogénica. Proponemos un protocolo de diferenciación basado en suero para la diferenciación de MyoD/BAF60C expresar hESCs en grupos de precursores miogénicas, seguido de incubación en medio definido libre de suero (que contiene transferrina insulina – SU) para lograr la conversión de los precursores miogénicas en miotubos esqueléticos. Sin embargo, es posible que otros medios definidos pueden lograr una diferenciación miogénica igual o mejor. Una limitación actual del protocolo es que se basa en el uso de suero bovino fetal, que, contiene ademásing muchas proteínas y sustancias de origen animal, muestra las variaciones de lote a lote. Esto puede resultar en una menor eficiencia o heterogeneidad de conversión miogénica dentro myospheres. Es de destacar que no todas las estructuras EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs son myospheres; es decir, algunos son agregados EB-como totalmente compuestas de fibras musculares. El número de myospheres normalmente derivadas de hESCs que expresan BAF60C y MyoD puede variar de 30 a 60% según lo estimado mediante inmunotinción sobre secciones EB realizó al final del protocolo (ver resultados). Un enfoque potencial para enriquecer a una placa de cultivo sólo myospheres sería el uso de un reportero miogénico. Esto facilitaría descartando los grupos EB-como diferenciados parcialmente o no, y seleccionar sólo los myospheres.
Por último, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a los requisitos temporales de los factores introducidos sería útil para mejorar el método de entrega. Por ejemplo, si BAF60C y MyoD se requieren sólo para SHtiempo ort "patear" las células en la dirección correcta, se podría aplicar métodos basados en la entrega ARNm modificado. Por el contrario, si se necesitan los factores para un tiempo más largo antes de que las células explotan sus proteínas endógenas, un enfoque episomal se recomienda para eliminar la variabilidad y efectos incontrolados debido a la integración en el genoma. Finalmente, observamos que es obligatorio para expresar BAF60C antes o al mismo tiempo como MyoD (nunca después) con el fin de lograr la conversión células madre en los músculos esqueléticos. El requisito previo para la expresión de BAF60C presumiblemente se basa en su papel en el pre-establecer el paisaje epigenético para la distribución adecuada de la cromatina a través de la MyoD genoma 6,15. Como tal, los futuros protocolos podrían mejorarse por compuestos u otras manipulaciones que estimulan la expresión BAF60C en hESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP es un Investigador Asociado del Centro de Investigación en Salud de Sanford Children. Este trabajo ha sido apoyado por las siguientes subvenciones a PLP: R01AR056712, R01AR052779 y P30 AR061303 del Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de la Salud (NIAMS), MDA y Sanford Children Premio de Investigación en Salud. Este trabajo se ha beneficiado en parte de financiación de la investigación a partir del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en el proyecto FP7-Health – 2009 ENDOSTEM 241440 (activación de las células madre asociadas vasculatura y las células madre de músculo para la reparación y el mantenimiento del tejido muscular) SA fue apoyada por. comunión CIRM.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |