هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي تلخص السمات البيولوجية البشرية عضلات الهيكل العظمي.
جيل من السكان متجانسة وفيرة من خلايا عضلات الهيكل العظمي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هو شرط لالعلاجات المستندة إلى الخلايا وعن "مرض في طبق" نموذج من الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. عقبات رئيسية، مثل انخفاض وفرة وتجانس السكان من الاهتمام، فضلا عن عدم وجود بروتوكولات لتشكيل هياكل مقلص ثلاثي الأبعاد، وحدت من تطبيقات الخلايا الجذعية لعلاج الاضطرابات العصبية والعضلية. لقد قمنا بتصميم البروتوكول الذي يتغلب على هذه الحدود من قبل مقدمة خارج الرحم من العوامل المحددة في hESCs – تحديد العضلات عامل MyoD وSWI / الجبهة الوطنية الصومالية لونين إعادة عرض المعقدة BAF60C عنصر – التي هي قادرة على إعادة برمجة hESCs إلى خلايا العضلات والهيكل العظمي. نحن هنا وصف أنشأ بروتوكول لتوليد myoblasts المستمدة HESC وتعزيز المجموعات في الهياكل ثلاثي الأبعاد المنمنمة (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7 </sup>.
بسبب قدرتها الفريدة على تجديد الذات مع الحفاظ على تعدد القدرات، وتعتبر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مصدرا لا يقدر بثمن في مجال الطب التجديدي. جيل الخلايا الجذعية إعادة تعمير بوساطة العضلات المريضة والخلايا الجذعية المحفزة أو HESC يسببها (التوجيهية) مشتقة من عضلات الهيكل العظمي لفي المختبر النمذجة المرض هي الأهداف الرئيسية من الدراسات التي تهدف إلى تحديد وتوضيح العلاجات التسبب في الكثير من الأمراض العصبية والعضلية. ومع ذلك، فقد تم الطعن هذه الدراسات من قبل المقاومة من hESCs تحويلها إلى خلايا عضلات الهيكل العظمي وقلة المعلومات بشأن تنظيم الجزيئي للHESC-الالتزام تجاه تكون العضل الهيكل العظمي. في الواقع، وكشف المحاولات السابقة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs ذلك فحسب الجسم مضغي الشكل السلالات (EB) مشتقة أو خلايا اللحمة المتوسطة هي المختصة لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل التالية التعبير خارج الرحم لتفعيل النسخي (على سبيل المثالPax3 أو Myf5) 1-3 أو عن طريق التعرض لظروف ثقافة معينة 4-5.
لقد أظهرنا سابقا أن المكون السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية، BAF60C (المشفرة بواسطة SMARCD3)، هو عنصر أساسي من آلات النسخ التي يسمح التنشيط بوساطة MyoD من مواضع محددة العضلات 6. لقد اكتشفت مؤخرا أن غياب الانتقائي للBAF60C يضفي على hESCs المقاومة إلى تفعيل بوساطة MyoD من الهيكل العظمي تكون العضل 7 أن لوحظ ذلك في BAF60C معربا عن الخلايا الجسدية 8-10، وهي عملية يشار إلى تحويل عضلي كما. التعبير القسري للBAF60C تمكن MyoD لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل مباشرة في hESCs، بناء على الظروف ثقافة معينة، مع BAF60C وMyoD فرض توقيع جينية التي تلزم hESCs نحو النسب عضلي 7. من المذكرة، كشف تحليل البروتين السابقة عدم وجود انتقائية من BAF60C، بين مكونات SWI / الجبهة الوطنية الصومالية، في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 11. استخدمنا هذه المعرفة لفرض الالتزام جينية من hESCs على النسب عضلي، مما يؤدي إلى توليد عدد سكانها متجانسة من myoblasts الهيكل العظمي التي يمكن تجميعها لتشكيل مقلص ثلاثية الأبعاد هياكل (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7. في الواقع، لدينا وسيلة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs يعتمد على التزام جينية من hESCs إلى النسب عضلي، والتي هي كامنة ظاهريا حتى تتعرض الخلايا إلى إشارات التمايز، مثل خلية التجميع والثقافة في التمايز المتوسطة (انظر بروتوكول معين). يسمح هذا استراتيجية التوسع في عدد السكان متجانسة من hESCs التي ترتكب epigenetically إلى نسب العضلات والهيكل العظمي ومناسبة لتشكيل myospheres مقلص ثلاثية الأبعاد التي ألخص النسيجية والخصائص الوظيفية للالهيكل العظميالعضلات. توفير myospheres أول دليل للعضلات المنمنمة استغلال ل"مرض في طبق" نموذجا للأمراض العضلات. عندما ولدت من مريض المستمدة iPSCs، هذه myospheres لديها القدرة على توضيح المسائل التنموية طويلة الأمد والتسبب في الأمراض النادرة، بالإضافة إلى تقديم إمكانيات هائلة كأداة لفحص إنتاجية عالية من المركبات العلاجية. نلاحظ أيضا أن واحدة قراءات الفوري لتحليل myosphere يمكن أن تقدمها المناعية على أقسام، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب عن طريق جوميز وآخرون 12
يصف البروتوكول المقترح هنا كيفية توليد مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres) مباشرة من hESCs. الاستراتيجية المقترحة لديه القدرة غير مسبوقة وغير عادية لإنتاج عضلات صغيرة في التعليق الذي يمكن أن تكون مناسبة بأنه "مرض في طبق" نموذج لكلا المقايسات فحص والدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لتوليد myospheres من hESCs واضحة ولا تحتاج إلى أي خطوة الفرز FACS خلال التمايز، والتي عادة ما لديها تأثير سلبي على العائد من الخلايا استردادها. الى جانب ذلك، فإن إجراء الفرز خلال التمايز تتداخل مع تجميع لأنه ينطوي على التفكك من EB إلى الخلايا واحد.
ويستند الطريقة المقترحة على reprograming جينية من hESCs مع عوامل محددة، MyoD وBaAF60C، والتي لا يتم التعبير عنها في الخلايا الجذعية الجنينية المحفزة. MyoD وBAF60C توفير "الأساسية" بروتين ال معقدةفي مواضع علامات الجيني الذي النسخ العائدات لتنشيط البرنامج عضلي الهيكل العظمي. يتم تسليم اثنين من العوامل إلى الخلايا عن طريق العدوى lentiviral وبالتالي فمن الأهمية بمكان الحصول على كفاءة عالية من إصابة كل من العوامل في جميع الخلايا. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام فيروسات عيار عالية أو الفيروسات هبوا علامات التحديد. شروط الثقافة أيضا تلعب دورا هاما في تحسين مدى تمايز عضلي. نقترح بروتوكول التمايز القائم على مصل للتمايز MyoD/BAF60C معربا عن hESCs في مجموعات السلائف عضلي، تليها حضانة في المصل خالية المتوسطة تحديدا (التي تحتوي على الانسولين ترانسفيرين – ITS) لتحقيق تحويل السلائف عضلي في myotubes الهيكل العظمي. ومع ذلك، فمن الممكن أن وسائل الإعلام تحديدا أخرى يمكن تحقيق التمايز عضلي مساوية أو أفضل. واحد الحد الحالي للبروتوكول هو أنه يعتمد على استخدام مصل بقري جنيني، والتي، إلى جانب احتواءالعديد من البروتينات الحيوانية والمواد جي، ويظهر الكثير إلى الكثير من الاختلافات. وهذا قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة أو عدم تجانس تحويل عضلي داخل myospheres. من المذكرة، وليس كل الهياكل EB-مثل المستمدة من BAF60/MyoD-expressing hESCs هي myospheres؛ وهي، وبعضها EB-مثل الركام يتكون بالكامل من myofibers. عدد myospheres المستمدة عادة من hESCs معربا عن BAF60C وMyoD يمكن أن تختلف 30-60٪ حسب تقديرات المناعية على المقاطع EB أجريت في نهاية البروتوكول (انظر نتائج). ومن شأن النهج المحتملة لإثراء الثقافة طبق لmyospheres فقط يكون لاستخدام مراسل عضلي. وهذا من شأنه تسهيل التخلص من الكتل EB-متباينة مثل جزئيا أو لا، واختيار فقط myospheres.
أخيرا، فإن فهم أفضل للآليات التي تقوم عليها الاشتراطات الزمنية من العوامل أدخلت تكون مفيدة لتحسين طريقة التسليم. على سبيل المثال، إذا كان هناك حاجة BAF60C وMyoD فقط لركلات الترجيحالوقت أورط الى "ركلة" الخلايا في الاتجاه الصحيح، يمكن أن تطبق على أساس أساليب تعديل تسليم مرنا. على النقيض من ذلك، إذا كانت هناك حاجة العوامل لفترة أطول قبل الخلايا استغلال البروتينات الخاصة بهم الذاتية، وهو نهج episomal سوف أوصى للقضاء على التباين والآثار غير المنضبط بسبب الاندماج في الجينوم. أخيرا، نلاحظ أنه إلزامي للتعبير عن BAF60C قبل أو في نفس الوقت الذي MyoD (أبدا بعد) من أجل تحقيق تحويل HESC في العضلات والهيكل العظمي. شرط للتعبير مسبقة من المفترض BAF60C يعتمد على دورها في وضع ما قبل المشهد جينية للتوزيع MyoD ونين السليم من خلال الجينوم 6،15. على هذا النحو، يمكن تحسين بروتوكولات المستقبل من خلال المركبات أو التلاعب الأخرى التي تشجع التعبير BAF60C في hESCs.
The authors have nothing to disclose.
حزب العمال التقدمي هو باحث مشارك في مركز أبحاث الصحة سانفورد للطفولة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح التالية لحزب العمال التقدمي: R01AR056712، R01AR052779 وP30 AR061303 من المعهد الوطني للصحة / المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية (NIAMS)، نجمة داود الحمراء وسانفورد الأطفال جائزة بحوث الصحية. وقد استفاد هذا العمل جزئيا من تمويل البحوث من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية في المشروع FP7 الصحة 2009 – ENDOSTEM 241440 (تفعيل الأوعية الدموية الخلايا الجذعية المرتبطة والخلايا الجذعية العضلية لإصلاح وصيانة الأنسجة العضلية) وأيد SA كتبها. CIRM الزمالة.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |