Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.
Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ikinci iskelet kas hücrelerinin homojen ve bol nüfusun Üretimi hücre bazlı terapiler için ve insan nöromüsküler hastalıklar modeli bir "bir bulaşık hastalık" için bir gerekliliktir. Örneğin düşük yoğunlukta ve ilgi nüfus, hem de üç boyutlu kasılma yapıların oluşumu için protokoller eksikliği heterojenlik gibi büyük engel, nöromüsküler bozukluklar için kök hücrelerin kullanımı da sınırlıdır. Biz HESC tanımlanan faktörlerin ektopik getirilmesi ile bu sınırları aşan bir protokol tasarladık – kas belirleyicidir MyoD ve SWI / SNF kromatin karmaşık bileşen BAF60C biçimlenme – iskelet kası hücrelerine hESC yeniden programlamak mümkün olduğunu. Burada protokol HESC türetilmiş miyoblastları oluşturmak ve üç boyutlu minyatür yapılar (myospheres) onların kümelenmeyi teşvik için kurulan açıklayan fonksiyonel taklit minyatür iskelet kasları 7 </sup>.
Pluripotensini koruyarak çünkü kendi benzersiz yeteneği kendini yenilemek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) rejeneratif tıpta paha biçilmez bir kaynak olarak kabul edilir. In vitro hastalık modelleme için iskelet kaslarının hastalıklı kas ve HESC-veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin hücre aracılı iskânından Kök (iPSC) türetilmiş nesil tedaviler belirlenmesi ve birçok nöromüsküler hastalıkların patogenezi tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaların önemli hedefleri vardır. Ancak bu çalışmalar iskelet kası hücrelerine dönüştürmek için hESC direnci ve iskelet Miyogenesis doğru HESC-taahhüdünün moleküler düzenlenmesi ile ilgili bilgilerin azlığı meydan olmuştur. Gerçekten de, hESC iskelet kası ata hücreleri üretmek için daha önceki girişimler sadece embriyoit gövde (EB) türetilmiş yavrularıyla veya mezenkimal hücreler transkripsiyonel aktivatör elemanının ve ektopik ifade (alttaki iskelet Miyogenesis aktif hale getirmek için yeterli olduğunu ortaya örPax3 veya Myf5) 1-3 ya da özel kültür koşulları 4-5 maruz kalma.
Daha önce (SMARCD3 tarafından kodlanan) SWI / SNF bileşen, BAF60C, kas özel lokusların 6 MyoD aracılı aktivasyonunu sağlar: transkripsiyonel makinelerin önemli bir bileşen olduğunu göstermiştir. Yakın zamanda BAF60C seçici olmaması HESC üzerine başka bir somatik hücreler 8-10 ifade BAF60C gözlenmiştir iskelet Miyogenesis 7'nin MyoD aracılı aktivasyonu için direnç kazandıran keşfettiler bir işlem genel olarak kas kaynaklı dönüştürme anılacaktır. BAF60C Zorla ifadesi doğrudan BAF60C ve miyojen soy 7 doğru hESC taahhüt epigenetik bir imza heybetli myod ile, belirli bir kültür şartlara bağlı, hESC iskelet Miyogenesis etkinleştirmek için myod sağlar. Not, önceki proteomik analiz BAF6 seçici olmadığını ortaya0C, SWI / SNF bileşenleri arasında, EKH 11. Biz üç boyutlu kasılma oluşturmak için toplanmış olabilir iskelet miyoblastların homojen bir nüfus nesil lider, miyojenik soy üzerine hESC epigenetik bir taahhüt altına bu bilgi kullanılır yapıları (myospheres), işlevsel taklit minyatür iskelet kasları 7. Nitekim, hESC iskelet kas atalarıdır üreten bizim yöntem böyle hücresi gibi hücreler farklılaşma sinyallere maruz kadar fenotipik gizildir miyogenik soyu, için hESC epigenetik taahhüt dayanır farklılaştırma ortamı içinde toplama ve kültür (belirli bir protokol bakınız). Bu strateji epigenetik iskelet kası soy kararlı ve histolojik iskelet ve fonksiyonel özellikleri özetlemek üç boyutlu kasılma myospheres oluşumuna uygun olan hESC bir homojendirler ve genişlemesine izin verenkaslar. Myospheres kas hastalıklarının modeli bir "bulaşık hastalık" için işletilebilir minyatür kasların ilk kanıt. Hasta türetilmiş iPSCs üretilen, bu myospheres tedavi edici bileşiklerin yüksek veri akışı tarama için bir araç olarak büyük potansiyel sunan ek olarak, uzun süredir devam eden gelişim soru aydınlatmak için potansiyel ve nadir hastalıkların patojenezi. Ayrıca Gomes et al. 12 ile bir JoVE protokolde tarif edildiği gibi analiz myosphere hemen tek bir okuma, bölme immünohistokimyasal olarak temin edilebilir olduğuna dikkat
Burada önerilen protokol doğrudan hESC kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeleri oluşturmak için nasıl açıklar. Önerilen strateji tarama deneyleri ve gelişim çalışmalarında hem modeli "bir çanak içinde hastalık" olarak uygun olabilir süspansiyon mini kasları üretmek için görülmemiş ve olağanüstü bir potansiyele sahip. Ayrıca, hESC myospheres üretmek için yöntem basittir ve tipik olarak geri kazanılan hücre verimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan farklılaşması sırasında herhangi bir FACS-ayırma adımı gerektirmez. Bu, tek hücre içine EB bir ayrışma olduğunu ima eder Bunun yanı sıra, farklılaşması sırasında bir ayırma prosedürü toplama müdahale olacaktır.
Önerilen yöntem, pluripotent kök hücrelerde ifade olmayan özel faktörlere ve MyoD BaAF60C ile hESC epigenetik reprograming dayanmaktadır. MyoD ve BAF60C "çekirdek" protein kompleksi TH sağlamakişaretleri de transkripsiyon iskelet miyojen programı etkinleştirmek için devam hangi genomik loci. Bu iki faktör lentiviral enfeksiyonların yoluyla hücrelere teslim ve bütün hücrelerde her iki faktörün enfeksiyon yüksek verim elde etmek için kritiktir edilir. Bu yüksek titreli bir virüs ya da seçim işaretçileri sahip virüs kullanılarak elde edilebilir. Kültür koşulları da kas kaynaklı farklılaşma ölçüde optimize de önemli bir rol oynamaktadır. Iskelet myotubes miyojen öncüllerinin dönüşüm elde etmek – Biz, serum serbest tanımlanmış ortamda inkübasyon (ITS insülin transferin içeren) izledi miyojen öncüleri kümeler halinde hESC ifade MyoD/BAF60C farklılaşması için bir serum bazlı farklılaşma protokol öneriyoruz. Ancak, diğer tanımlanmış medya eşit veya daha iyi miyojen farklılaşma elde etmesi mümkündür. Protokolün bir akım sınırlama yanında içeren, fetal sığır serumu, kullanımına dayanır olmasıdırbirçok hayvan proteinleri ve maddeler ing, çok partiye farklılıklar göstermektedir. Bu myospheres içinde kas kaynaklı dönüşümü daha düşük verimlilik veya heterojen neden olabilir. Notun, BAF60/MyoD-expressing hESC türetilen tüm EB-benzeri yapılar myospheres değil; yani, bazı tamamen myofibers oluşan EB gibi agrega vardır. (Sonuçlar bakınız) protokolünün sonunda gerçekleştirilen EB bölümleri üzerinde imüno-boyama ile tahmin edildiği üzere, normal BAF60C ve MyoD ifade hESC türetilen myospheres sayısı 30 ila 60% arasında değişebilir. Sadece myospheres için bir kültür çanak zenginleştirmek için olası bir yaklaşım miyojen muhabiri kullanmak olacaktır. Bu, kısmen ya da farklılaşmış EB benzeri gruplar atarak ve sadece myospheres seçerek kolaylaştıracaktır.
Son olarak, tanıtılan faktörlerin zamansal şartları altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması teslimat yöntemi geliştirmek için yararlı olacaktır. Örneğin, BAF60C ve MyoD sadece sh için gereklidirort zaman doğru yönde "tekme" hücreleri için, modifiye mRNA teslim dayalı yöntemler uygulanabilir olabilir. Faktörleri hücreler, endojen proteinler istismar önce daha uzun bir süre için gereklidir Buna karşın eğer, epizomal bir yaklaşım değişkenliği ve genomuna entegrasyonu nedeniyle kontrolsüz etkilerini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. Son olarak, bu önce, iskelet kas içine HESC dönüşüm elde etmek için ya da MyoD (hiçbir zaman sonra) ile aynı anda BAF60C ifade etmek için zorunlu olduğunu not edin. BAF60C önceden ekspresyonu için gereksinim muhtemelen genom 6,15 ile uygun MyoD kromatin dağıtımı için epigenetik manzara ön ayar rolü dayanır. Gibi, gelecekte protokoller bileşikler veya hESC BAF60C ifadesini destekleyen diğer manipülasyonlar tarafından geliştirilmiş olabilir.
The authors have nothing to disclose.
PLP Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma Merkezi'nin bir Associate Araştırmacı. R01AR056712, R01AR052779 ve Artrit ve Kas-iskelet Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları (NIAMS), MDA ve Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma ödül gelen P30 AR061303: Bu çalışma PLP'ye aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen projede Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı araştırma fonlarından yararlandı FP7-Sağlık – 2009 ENDOSTEM 241440 (tamir ve kas dokusunun bakımı için damar ilişkili kök hücre ve kas kök hücrelerinin aktivasyonu) SA tarafından desteklenmiştir. CIRM dostluk.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |