ここでは、許容的培養条件下でヒトの生物学的特徴を再現収縮筋線維(myospheres)の三次元クラスターを形成し、骨格筋前駆細胞の均質な集団を生成することに向けて、ヒト胚性幹細胞(hESC)のエピジェネティックな再プログラミングに基づくプロトコルを記載骨格筋。
ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)からの骨格筋細胞の均質かつ豊富な人口の生成は細胞ベースの治療のために、人間の神経筋疾患のモデル「皿の中の病気」のための必要条件である。このような低存在量および目的の集団、ならびに三次元収縮構造の形成のためのプロトコルの欠如の不均一性などの主要なハードルは、神経筋障害のための幹細胞の用途が限られている。複雑なコンポーネントのBAF60C改造筋肉決定因子MyoDのとSWI / SNFクロマチン – – 私たちは、ヒトES細胞における定義された要因の異所性を導入することにより、これらの制限を克服し、プロトコルを設計した骨格筋細胞にヒトES細胞を再プログラムすることができること。ここでは、プロトコルがhESC由来筋芽細胞を生成し、三次元小型化された構造(myospheres)に彼らのクラスタ化を推進するために設立さについて説明し、その機能的に模倣する小型化された骨格筋7 </sup>。
多能性を維持しながら、そのために彼らのユニークな能力の自己再生、ヒト胚性幹細胞(ヒトES細胞)は、再生医療での貴重な情報源と考えられている。 インビトロ疾患モデリングのための骨格筋の病気の筋肉とのhESCまたは誘導多能性幹細胞の細胞媒介性再増殖(IPSC)由来の生成幹する治療を同定し、多くの神経筋疾患の病因の解明を目的とした研究の主要な目標である。しかし、これらの研究は、骨格筋細胞に変換するhESCの抵抗によって、骨格筋形成に向けてのhESC-コミットメントの分子規制に関する情報の不足によって挑戦されてきた。実際、ヒトES細胞から骨格筋前駆細胞を生成するための従来の試みは、胚様体(EB)由来の子孫や、間葉系細胞は、転写活性化因子の異所性発現後の骨格筋形成を活性化させる能力があることを明らかにした( 例:PAX3またはMyf5の)1-3または特定の培養条件4-5への暴露による。
我々は以前(SMARCD3によってコードされる)、SWI / SNF複合コンポーネント、BAF60Cは、筋特異的遺伝子座6のMyoDの媒介活性化を可能にする転写機構の不可欠な構成要素であることを示した。我々は最近、BAF60Cの選択がない場合は、そうでないBAF60Cで観察され、骨格筋形成7のMyoDの媒介活性化に対する抵抗は、8月10日 、一般的に筋原変換と呼ばれるプロセスを体細胞に発現ヒトES細胞に与えることを発見した。 BAF60Cの強制発現は、直接BAF60CとのMyoDは筋形成系譜7に向けてヒトES細胞をコミットエピジェネティックな署名を課すことで、特定の培養条件により、ヒトES細胞、骨格筋形成を活性化するためにMyoDのを可能にします。注目すべきは、前のプロテオーム解析がBAF6を選択的に存在しないことを明らかにした0Cは、SWI / SNFのうち、ESCは11に。我々は3次元の収縮を形成するために集約することができた骨格筋芽細胞の均質な集団の生成につながる、筋原系統へのhESCのエピジェネティックなコミットメントを課すためにこの知識を使用構造(myospheres)機能的に模倣小型化された骨格筋7。実際、ヒトES細胞から骨格筋前駆細胞を生成する手法は、細胞など、細胞が分化シグナルに露出するまで、表現型潜伏ある筋原系統へのhESCのエピジェネティックなコミットメントに依存しています分化培地での集計·文化(特定のプロトコルを参照してください)。この戦略は、後成的骨格筋系譜にコミットし、骨格の組織学的および機能的特性を再現3次元収縮myospheresの形成に適しているヒトES細胞の均質な集団の拡大が可能に筋肉。 myospheresは筋疾患のモデル「皿の中の病気」のために悪用可能な小型化された筋肉の最初の証拠を提供しています。患者に由来するiPS細胞から生成されると、これらのmyospheresは治療用化合物のハイスループットスクリーニングのためのツールとして大きな可能性を提供することに加えて、長年の発達疑問を解明する可能性と希少疾患の病因を持っている。また、ゴメスら 12によるJoveのプロトコルに記載のようにmyosphere分析の一つの即時読み出しは、切片上で免疫組織化学によって提供され得ることに注意
ここで提案されているプロトコルは、直接ヒトES細胞から収縮筋線維(myospheres)の3次元のクラスタを生成する方法について説明します。提案された戦略は、スクリーニングアッセイと発達研究の両方のためのモデル」皿に疾患」として適切であり得る懸濁液中のミニ筋肉を生成するためにこれまでにないと異常性を秘めています。また、ヒトES細胞からmyospheresを生成するための方法は簡単で、一般的に回収された細胞の収量に悪影響を及ぼし、分化、中の任意のFACSソーティング工程を必要としない。それは単一細胞にEBの解離を意味するのでまた、分化中のソート手順が集計を妨害する。
提案手法は、多能性胚性幹細胞で発現していない特定の要因のMyoDおよびBaAF60CでヒトES細胞のエピジェネティックなreprogramingに基づいています。のMyoDおよびBAF60Cは「コア」とは、タンパク質の複雑な目を提供マークの転写は、骨格筋形成プログラムを起動に進み、そこからゲノム遺伝子座。二つの要因は、レンチウイルス感染により細胞に送達し、すべての細胞中の両方の因子の感染の高い効率を得ることが重要であるている。これは、選択マーカーを付与高力価のウイルスまたはウイルスを使用することによって達成することができる。培養条件はまた、筋形成分化の程度を最適化する際に重要な役割を果たす。骨格筋管に筋原前駆体の変換を達成するために – 私たちは、無血清限定培地(ITSインスリントランスフェリンを含む)中で培養した筋原前駆体のクラスターの中にヒトES細胞を表現MyoD/BAF60C分化のための血清ベースの分化プロトコルを提案する。しかしながら、他の定義されたメディアが同等以上の筋形成分化を達成することができる可能性がある。プロトコルの一電流制限は、他に含まれている、ウシ胎児血清の使用に依存していることである多くの動物性タンパク質や物質のING、ロット間のばらつきを示している。これはmyospheres内筋原変換効率の低下や不均一性の原因となります。注目すべきは、BAF60/MyoD-expressingヒトES細胞から派生したすべてのEB様構造はmyospheresいるわけではありません。つまり、いくつかは完全に筋線維から構成されるEB状の集合体である。 (結果を見る)プロトコルの最後に実行EB切片上で免疫染色により推定され、通常BAF60CとのMyoDを発現しているヒトES細胞から誘導されたmyospheresの数は百分の30から60まで変化することができる。唯一myospheres用培養皿を豊かにする可能性のあるアプローチは、筋原性レポーターを使用することです。これは部分的かに分化し、EB様クラスターを破棄し、唯一myospheres選択が容易になる。
最後に、導入された要因の時間的要件のメカニズムをよりよく理解するには、配信の方法を改善することは有用であろう。例えば、BAF60CおよびMyoDのは、SHのために必要な場合「キック」にORT時間右方向のセルは、修正されたmRNAの配信に基づいた方法が適用される場合があります。因子は、細胞がそれらの内因性タンパク質を利用する前に、より長い時間のために必要とされる場合には対照的に、エピソームアプローチが変動し、ゲノムへの組込みに起因する制御されない影響を排除することが推奨されるであろう。最後に、我々はそれが前に骨格筋へのhESCの変換を達成するためにするかのMyoD(決して後)と同時にBAF60Cを表現するために必須であることに注意してください。 BAF60Cの前に発現させるための必要条件は、おそらくゲノム6,15を通じて適切MyoDのクロマチン分布のためのエピジェネティックな風景を前の設定におけるその役割に依存しています。このように、将来のプロトコルは、化合物またはヒトES細胞におけるBAF60C発現を促進他の操作で改善される場合があります。
The authors have nothing to disclose.
PLPはサンフォード子供の健康研究センター准研究者でもある。 R01AR056712、R01AR052779、関節炎と筋骨格系の健康/国立研究所の国立研究所と皮膚疾患(NIAMS)、MDAおよびサンフォード児童保健研究賞からP30のAR061303:この作品は、PLPに次の補助金によって支えられてきた。本研究の一部プロジェクトでの欧州共同体の第七次フレームワーク計画からの研究資金の恩恵を受けているFP7-健康- 2009 ENDOSTEM 241440( 修理や筋肉組織の維持のために血管系に関連する幹細胞や筋肉幹細胞の活性化)SAはサポートされていました。 CIRMフェローシップ。
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |