כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.
דור של אוכלוסייה הומוגנית ושפע של תאי שריר שלד מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הוא דרישה לטיפולים מבוססי תאים ול" מחלה בצלחת "מודל של מחלות neuromuscular אדם. מכשולים עיקריים, כגון שפע וההטרוגניות של האוכלוסייה של עניין, כמו גם חוסר פרוטוקולים להיווצרות של מבני התכווצות תלת ממדים נמוכים, הגבילו את היישומים של תאי גזע לטיפול בהפרעות התוקפת. יש לנו תוכנן פרוטוקול המתגבר על מגבלות אלה על ידי הכנסה מחוץ לרחם של גורמים שהוגדרו בhESCs – MyoD גורם נחישות השריר והכרומטין SWI / SNF שיפוץ BAF60C רכיב מורכב – כי הם מסוגלים לתכנת מחדש hESCs לתאי שרירי שלד. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול מבוסס כדי ליצור myoblasts נגזר hESC ולקדם את האשכולות שלהם לתוך מבני tridimensional מיניאטורי (myospheres) שרירי שלד מיניאטורי פונקציונלי לחקות 7 </sup>.
בגלל היכולת הייחודית שלהם לעצמית לחדש תוך שמירת pluripotency, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נחשבים משאב יקר ערך ברפואת רגנרטיבית. דור גזע אכלוס תא בתיווך של שרירים פגועים ותאי hESC או גזע pluripotent מושרה (iPSC) נגזר של שרירי שלד לדוגמנות מחלה במבחנה הם מטרות עיקריות של מחקרים שמטרתם איתור וטיפולי הבהרה בפתוגנזה של מחלות רבות התוקפת. עם זאת, מחקרים אלה כבר לערער על ידי ההתנגדות של hESCs להמיר לתאי שרירי שלד ועל ידי מיעוט מידע לגבי הרגולציה המולקולרית של hESC-מחויבות כלפי myogenesis שלד. ואכן, ניסיונות קודמים ליצור אבות שרירי שלד מhESCs גילו כי רק גוף embryoid progenies (EB) נגזרת או תאי mesenchymal מוסמך להפעיל myogenesis השלד הבא ביטוי מחוץ לרחם של מפעילי תעתיק (לדוגמא:PAX3 או Myf5) 1-3 או על ידי חשיפה לתנאי תרבות הספציפיות 4-5.
הראינו בעבר כי רכיב SWI / SNF, BAF60C (המקודד על ידי SMARCD3), הוא מרכיב חיוני של מכונות תעתיק המאפשרת הפעלה בתיווך MyoD של לוקוסי שרירים ספציפיים 6. יש לנו גילינו לאחרונה כי ההיעדר סלקטיבית של BAF60C מקנה על hESCs ההתנגדות להפעלה בתיווך MyoD של myogenesis שלד 7 כי הוא ציין אחרת בBAF60C לבטא בתאים סומטיים 8-10, תהליך המכונות המרת myogenic כ. ביטוי מאולץ של BAF60C מאפשר MyoD להפעיל ישירות myogenesis השלד בhESCs, בתנאי תרבות ספציפיים, עם BAF60C וMyoD הטלת חתימה אפיגנטיים המתחייבת hESCs כלפי שושלת myogenic 7. ראוי לציין, ניתוח proteomic הקודם חשף את ההיעדר סלקטיבית של BAF60C, בין רכיבי SWI / SNF, ב11 ESCs. השתמשו בידע זה כדי להטיל מחויבות אפיגנטיים של hESCs על שושלת myogenic, מוביל את הדור של אוכלוסייה הומוגנית של myoblasts שלד שיכול להצטבר ליצירת התכווצות תלת ממדים מבנים (myospheres) כי שרירים פונקציונלי לחקות מיניאטורי שלד 7. אכן, השיטה של יצירת תאי אב שרירי שלד מhESCs מסתמכת על המחויבות אפיגנטיים של hESCs לשושלת myogenic, שהוא phenotypically סמויה עד תאים נחשפים לאותות בידול, כגון תא צבירה ותרבות במדיום התמיינות (ראה פרוטוקול ספציפי). אסטרטגיה זו מאפשרת הרחבה של אוכלוסייה הומוגנית של hESCs שepigenetically מחויבים לשושלת שרירי שלד ומתאימה להיווצרות myospheres התכווצות תלת ממדים כי לשחזר היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים של שלדשרירים. Myospheres מספק את ההוכחה הראשונה של שרירים מוקטנים לניצול ל" מחלה בצלחת "מודל של מחלות שרירים. כאשר נוצר מiPSCs המטופל נגזר, יש לי myospheres אלה הפוטנציאל לברר שאלות התפתחותיות ארוכי שנים ופתוגנזה של מחלות נדירות, בנוסף למציע פוטנציאל האדיר ככלי להקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות טיפוליות. אנחנו גם לציין כי קריאת נתונים מיידיות אחד של ניתוח myosphere יכולים להיות מסופקים על ידי אימונוהיסטוכימיה על סעיפים, כפי שתוארו בפרוטוקול יופיטר על ידי גומז et al. 12
הפרוטוקול המוצע כאן מתאר כיצד ליצור אשכולות תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres) ישירות מhESCs. יש האסטרטגיה המוצעת פוטנציאל חסר תקדים ויוצא דופן כדי לייצר את שרירי מיני בהשעיה שיכולה להיות מתאים כמו "מחלה בצלחת" מודל עבור שני מבחני מיון ומחקרים התפתחותיים. יתר על כן, השיטה לייצר myospheres מhESCs היא פשוטה ואינה דורשת כל צעד מיון FACS במהלך ההתמיינות, אשר בדרך כלל יש לו השפעה שלילית על התשואה של תאים התאוששו. חוץ מזה, הליך מיון במהלך ההתמיינות יפריע לצבירה מכיוון שהיא מרמזת ניתוק של EB לתוך תאים בודדים.
השיטה המוצעת מבוססת על reprograming אפיגנטיים של hESCs עם גורמים ספציפיים, MyoD וBaAF60C, שאינם באים לידי ביטוי בתאי גזע עובריים pluripotent. MyoD וBAF60C לספק את ה החלבון המורכבת "הליבה"בסימני הלוקוסים הגנומי שממנו השעתוק ממשיך להפעיל את תכנית myogenic השלד. שני הגורמים מועברים לתאים בדרך של זיהומי lentiviral ולכן זה קריטי כדי להשיג את יעילות גבוהה של זיהום של שני הגורמים בכל התאים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בוירוסי כייל גבוהים או וירוסי ניחן סמני בחירה. תנאי תרבות גם לשחק תפקיד חשוב באופטימיזציה של מידת בידול myogenic. אנו מציעים מבוססי פרוטוקול סרום בידול לבידול של MyoD/BAF60C להביע hESCs לתוך אשכולות של מבשרי myogenic, ואחריו דגירה במדיום מוגדר סרום ללא (המכיל אינסולין transferrin – ITS) כדי להשיג המרה של מבשרי myogenic לmyotubes שלד. עם זאת, זה אפשרי, כי תקשורת מוגדרת אחרת יכולה להשיג בידול myogenic שווה או טוב יותר. מגבלה הנוכחית של הפרוטוקול היא שהוא מסתמך על השימוש בסרום שור עוברי, אשר, מלבד להכילing חלבונים מן החי וחומרים רבים, מציג וריאציות הרבה להרבה. זה עלול לגרום ליעילות נמוכה יותר או ההטרוגניות של המרה myogenic בתוך myospheres. ראוי לציין, שלא כל המבנים דמויי-EB נגזרים מBAF60/MyoD-expressing hESCs הם myospheres; כלומר, חלקם מצרפים כמו EB לחלוטין המורכב של myofibers. מספר myospheres בדרך כלל נגזר מhESCs להביע BAF60C וMyoD יכול להשתנות 30-60% כפי שהוערך על ידי immunostaining על סעיפי EB שבוצעו בסוף הפרוטוקול (ראה תוצאות). גישת פוטנציאל להעשיר את המנה תרבות לmyospheres רק תהיה להשתמש כתב myogenic. זה יקל על השלכת האשכולות כמו EB באופן חלקי או לא מובחנים ובחירה רק myospheres.
לבסוף, הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס הדרישות זמניות של הגורמים הציגו תהיה שימושית כדי לשפר את השיטה של מסירה. לדוגמא, אם BAF60C וMyoD נדרשים רק עבור shזמן אורט "בעיטה" התאים בכיוון הנכון, שיטות המבוססות על משלוח mRNA שונה יכול להיות מיושמת. לעומת זאת, אם הגורמים נדרשים לזמן ארוך יותר לפני שהתאים לנצל החלבונים אנדוגניים שלהם, גישת episomal תהיה מומלצת לחסל את השונות והשפעות בלתי מבוקרות בשל האינטגרציה בגנום. לבסוף, נציין שזה חובה להביע BAF60C לפני או במקביל לMyoD (לא לאחר) על מנת להשיג גיור hESC לשרירי שלד. הדרישה לביטוי מוקדם של BAF60C ככל הנראה מסתמכת על תפקידה בהגדרה מראש הנוף אפיגנטיים להפצת הכרומטין MyoD נכונה דרך הגנום 6,15. ככזה, פרוטוקולי עתיד עשויים להיות משופרים על ידי תרכובות או מניפולציות אחרות שמקדמות ביטוי BAF60C בhESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP הוא חוקר עמית במרכז לבריאות המחקר של סנפורד לילדים. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי PLP: R01AR056712, R01AR052779 וAR061303 P30 מהמכון הלאומי לבריאות / המכון לאומי של דלקת מפרקים ושלד ושרירים ומחלות עור (NIAMS), מד"א ואת הפרס לחקר בריאות ילדי סנפורד. עבודה זו יש נהנתה בחלק ממימון מחקר מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית בפרויקט FP7-בריאות – 2009 ENDOSTEM 241,440 (הפעלה של תאי כלי דם הקשורים גזע ותאי גזע שריר לתיקון והתחזוקה של רקמת שריר) SA נתמכה על ידי. מלגת CIRM.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |