Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.
Geração de uma população homogênea e abundante de células do músculo esquelético a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) é um requisito para terapias baseadas em células e para uma "doença em um prato de" modelo de doenças neuromusculares humanas. Principais obstáculos, como a baixa abundância e heterogeneidade da população de interesse, bem como a falta de protocolos para a formação de estruturas contráteis tridimensionais, têm limitado as aplicações de células-tronco para doenças neuromusculares. Criamos um protocolo que supera esses limites por introdução ectópica de fatores definidos no hESCs – o fator MyoD determinação muscular e SWI / SNF cromatina remodelação complexo BAF60C componente – que são capazes de reprogramar hESCs em células musculares esqueléticas. Aqui nós descrevemos o protocolo estabelecido para gerar mioblastos derivados de células estaminais embrionárias humanas e promover o seu agrupamento em estruturas miniaturizadas tridimensionais (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados 7 </sup>.
Por causa de sua habilidade única de auto-renovação, mantendo pluripotência, as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são considerados um recurso valioso na medicina regenerativa. Geração de células-tronco repovoamento mediada dos músculos doentes e células-hESC ou tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas de músculos esqueléticos in vitro para modelagem de doenças são metas fundamentais de estudos que visam identificar tratamentos e elucidar a patogênese de muitas doenças neuromusculares. No entanto, estes estudos têm sido desafiados pela resistência de hESCs para converter em células musculares esqueléticas e pela escassez de informações sobre a regulação molecular de células estaminais embrionárias humanas-compromisso com tecido muscular esquelético. De fato, as tentativas anteriores para gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs revelou que apenas corpo embryoid progênies (EB) derivados ou células mesenquimais são competentes para ativar tecido muscular esquelético seguinte expressão ectópica de ativadores de transcrição (por exemplo,Pax3 ou Myf5) 1-3, ou por exposição a condições específicas de cultura 4-5.
Temos anteriormente mostrado que o componente de SWI / SNF, BAF60C (codificado por SMARCD3), é um componente essencial da maquinaria transcricional que permite a activação mediada por MyoD de loci específicos do músculo 6. Descobrimos recentemente que a ausência selectiva de BAF60C confere hESCs para a resistência à activação mediada por MyoD de tecido muscular esquelético 7 que é de outro modo observada no BAF60C expressando células somáticas 8-10, num processo vulgarmente referido como conversão miogénica. Expressão forçada de BAF60C permite MyoD ativar diretamente tecido muscular esquelético em hESCs, mediante condições específicas de cultura, com BAF60C e MyoD impor uma assinatura epigenética que comete hESCs para a linhagem miogênica 7. De nota, a análise proteômica anterior revelou a ausência seletiva de BAF60C, entre os componentes SWI / SNF, na CES 11. Nós usamos este conhecimento para impor um compromisso epigenética de hESCs na linhagem miogênica, levando à geração de uma população homogênea de mioblastos esqueléticos que podem ser agregados para formar contrátil tridimensional estruturas (myospheres) que funcionalmente imitam músculos esqueléticos miniaturizados 7. Na verdade, o nosso método de gerar progenitores musculares esqueléticas de hESCs conta com o compromisso de epigenética hESCs à linhagem miogênica, que é fenotipicamente latente até que as células são expostas a sinais de diferenciação, tais como células agregação e cultura em meio de diferenciação (ver protocolo específico). Esta estratégia permite a expansão de uma população homogénea de hESCs que estão comprometidos com a linhagem epigenètica músculo esquelético e adequado para a formação de myospheres contrácteis tridimensionais que recapitulam histológica e as propriedades funcionais de esqueléticomúsculos. Os myospheres fornecem a primeira evidência de músculos miniaturizados exploráveis por uma "doença em um prato de" modelo de doenças musculares. Quando gerada a partir de pacientes provenientes iPSCs, estes myospheres têm o potencial para elucidar questões de desenvolvimento de longa data e patogênese de doenças raras, além de oferecer o enorme potencial como ferramenta de alto throughput screening de compostos terapêuticos. Observamos também que uma leitura imediata de análise myosphere poderia ser fornecido por imuno-histoquímica em seções, como descrito em um protocolo JOVE por 12 Gomes et al.
O protocolo proposto aqui descreve como gerar agrupamentos tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres) diretamente do hESCs. A estratégia proposta tem o potencial sem precedentes e extraordinário para a produção de mini músculos em suspensão que pode ser apropriado como uma "doença em um prato de" modelo para ambos os ensaios de avaliação e estudos de desenvolvimento. Além disso, o método para gerar myospheres de hESCs é simples e não requer qualquer passo de triagem FACS durante a diferenciação, o que tipicamente tem um impacto negativo sobre o rendimento das células recuperadas. Além disso, um procedimento de classificação durante a diferenciação iria interferir com a agregação, uma vez que implica uma dissociação da EB em células individuais.
O método proposto é baseado na reprogramação epigenética de hESCs de factores específicos, MyoD e BaAF60C, que não são expressos em células-tronco embrionárias pluripotentes. MyoD e BAF60C fornecer o "core" da proteína ª complexoem marcas loci genômico a partir do qual procede a transcrição para ativar o programa miogênica esquelético. Os dois factores são entregues às células por meio de infecções lentivirais e, por conseguinte, é essencial para obter uma elevada eficiência de infecção de ambos os factores em todas as células. Isto pode ser conseguido através da utilização de vírus com título elevado ou vírus dotados de marcadores de selecção. As condições de cultura, também desempenham um papel importante na optimização da extensão da diferenciação miogénica. Propomos um protocolo de diferenciação à base de soro para a diferenciação de MyoD/BAF60C expressando hESCs em conjuntos de precursores miogénicas, seguido por incubação em meio definido isento de soro (contendo transferrina insulina – STI) para alcançar a conversão de precursores miogénicos em miotubos esqueléticos. No entanto, é possível que outros meios definidos pode atingir uma diferenciação miogénica igual ou melhor. Uma limitação de corrente de que o protocolo é que ele se baseia na utilização de soro fetal de bovino, o qual, além de contering muitas proteínas animais e substâncias, mostra as variações de lote para lote. Isso pode resultar em menor eficiência ou heterogeneidade de conversão miogênica dentro myospheres. De notar que nem todas as estruturas de EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs são myospheres; ou seja, alguns estão agregados EB-como inteiramente compostas de miofibras. O número de myospheres normalmente derivadas hESCs expressam BAF60C MyoD e pode variar de 30 a 60%, tal como estimada por imunocoloração em secções EB realizadas no final do protocolo (ver Resultados). Uma abordagem potencial para o enriquecimento de um prato de cultura para apenas myospheres seria a utilização de um repórter miogénica. Isso facilitaria descartando os clusters EB-como parcialmente ou não diferenciados e selecionando apenas os myospheres.
Por último, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes às exigências temporais dos factores introduzidos seria útil para melhorar o método de administração. Por exemplo, se BAF60C e MyoD são necessárias apenas para shmomento ou a "chutar" as células na direção certa, métodos baseados na entrega mRNA modificado pode ser aplicada. Por outro lado, se os factores são necessários para um tempo mais longo antes de as células de explorar as suas proteínas endógenas, uma abordagem epissomal seria recomendada para eliminar a variabilidade e efeitos não controlados devido a integração no genoma. Finalmente, observa-se que é imperativo para expressar BAF60C antes ou ao mesmo tempo que MyoD (nunca depois), a fim de obter a conversão hESC em músculos esqueléticos. A exigência de expressão antes de BAF60C depende presumivelmente sobre o seu papel na pré-configuração da paisagem epigenética para o bom distribuição MyoD cromatina através do genoma 6,15. Como tal, os futuros protocolos pode ser melhorada através de compostos ou outras manipulações que promovem a expressão BAF60C em hESCs.
The authors have nothing to disclose.
PLP é um Investigador Associado do Centro de Investigação em Saúde da Sanford Children. Este trabalho foi suportado pelos seguintes subvenções a PLP: R01AR056712, R01AR052779 e P30 AR061303 do Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artrite e musculosqueléticas Saúde e Doenças da pele (NIAMS), MDA e Sanford Children prêmio Health Research. Este trabalho tem, em parte, beneficiaram de financiamento da investigação de Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia no projeto FP7-Saúde – 2009 ENDOSTEM 241440 (Ativação da vasculatura células-tronco associadas e células-tronco musculares para a reparação e manutenção do tecido muscular) SA foi apoiado por. comunhão CIRM.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |