Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d'une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l'homme les muscles squelettiques.
La génération d'une population homogène et abondante de cellules musculaires squelettiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) est une exigence pour des thérapies à base de cellules et pour une "maladie dans une boîte de" modèle de maladies neuromusculaires humaines. Obstacles majeurs, tels que la faible abondance et l'hétérogénéité de la population d'intérêt, ainsi que l'absence de protocoles pour la formation de structures contractiles trois dimensions, ont limité les applications des cellules souches pour les maladies neuromusculaires. Nous avons un protocole qui permet de surmonter ces limites, par introduction ectopique de facteurs définis dans hESCs – le facteur de détermination de MyoD muscle et SWI / SNF de remodelage de la chromatine BAF60C composant complexe – qui sont en mesure de reprogrammer hESCs dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici le protocole établi pour générer des myoblastes de CSEh dérivées et promouvoir leur regroupement en structures tridimensionnelles miniaturisés (de myospheres) que les muscles squelettiques miniaturisés fonctionnellement imiter 7 </sup>.
En raison de leur capacité unique d'auto-renouvellement, tout en conservant la pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont considérés comme une ressource inestimable pour la médecine régénérative. Génération des cellules souches repeuplement médiation des muscles malades et les cellules CSEh ou souches pluripotentes induites (iPSC) dérivés des muscles squelettiques pour la modélisation de la maladie in vitro sont des objectifs clés des études visant à identifier les traitements et élucider la pathogenèse de nombreuses maladies neuromusculaires. Cependant, ces études ont été contestées par la résistance de CSEh à convertir en cellules musculaires squelettiques et par le manque d'informations en ce qui concerne la régulation moléculaire de CSEh engagement envers la myogenèse squelettique. En effet, les précédentes tentatives pour générer des progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh ont révélé que seul organe embryoïde des descendances (EB) dérivés ou des cellules mésenchymateuses sont compétents pour activer la myogenèse squelettique suivant l'expression ectopique de activateurs de transcription (par exemple,Pax3 ou Myf5) 1-3 ou par exposition à des conditions de culture spécifiques 4-5.
Nous avons précédemment montré que le composant SWI / SNF, BAF60C (codée par SMARCD3), est une composante essentielle de la machinerie transcriptionnelle qui permet l'activation de MyoD médiation de spécifique du muscle loci 6. Nous avons récemment découvert que l'absence sélective de cellules hES sur BAF60C confère la résistance à l'activation de MyoD à médiation de la myogenèse squelettique 7 qui est par ailleurs observée dans les cellules somatiques exprimant BAF60C 8-10, un procédé couramment appelé conversion myogénique. Expression forcée de BAF60C permet MyoD pour activer directement la myogenèse squelettique dans les CSEh, des conditions de culture spécifiques, avec BAF60C et MyoD imposant une signature épigénétique qui commet CSEh vers la lignée myogénique 7. Fait à noter, l'analyse protéomique précédente a révélé l'absence sélective de BAF60C, parmi les composants SWI / SNF, dans CES 11. Nous avons utilisé ces connaissances pour imposer un engagement épigénétique des CSEh sur la lignée myogénique, conduisant à la génération d'une population homogène de myoblastes squelettiques pouvant être regroupés pour former contractile en trois dimensions structures (myospheres) que les muscles fonctionnellement imiter miniaturisés squelettiques 7. effet, notre méthode de génération de progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh s'appuie sur l'engagement épigénétique de CSEh à la lignée myogénique, qui est phénotypiquement latente jusqu'à ce que les cellules sont exposées à des signaux de différenciation, comme cellule l'agrégation et de la culture en milieu de différenciation (voir protocole spécifique). Cette stratégie permet l'expansion d'une population homogène de cellules hES qui sont épigénétique engagé à lignage musculaire squelettique et adapté à la formation de myospheres contractiles tridimensionnelles qui récapitulent histologiques et des propriétés fonctionnelles du squelettemuscles. Les myospheres fournissent la première preuve de muscles miniaturisés exploitables pour une «maladie dans un plat" modèle de maladies musculaires. Quand elle est générée à partir de dérivées patient CSPi, ces myospheres ont le potentiel pour élucider les questions de développement de longue date et la pathogenèse des maladies rares, en plus d'offrir l'énorme potentiel comme outil de criblage à haut débit de composés thérapeutiques. Nous notons également que l'une lecture immédiate de myosphere analyse pourrait être fournie par immunohistochimie sur coupes, comme décrit dans un protocole de JoVE par Gomes et al. 12
Le protocole proposé ici décrit comment générer des grappes en trois dimensions des fibres musculaires contractiles (de myospheres) directement à partir de CSEh. La stratégie proposée a le potentiel sans précédent et extraordinaire pour produire des mini muscles en suspension qui peuvent être utilisées comme une «maladie dans un plat de« modèle pour les deux tests de dépistage et des études sur le développement. En outre, le procédé pour générer des cellules hES de myospheres est simple et ne nécessite aucune étape de tri par FACS au cours de la différenciation, ce qui a généralement un effet négatif sur le rendement en cellules récupérées. Par ailleurs, une procédure de tri au cours de la différenciation serait interférer avec l'agrégation, car il implique une dissociation de l'EB dans des cellules individuelles.
La méthode proposée est basée sur la reprogrammation épigénétique de CSEh à des facteurs spécifiques, MyoD et BaAF60C, qui ne sont pas exprimés dans les cellules souches embryonnaires pluripotentes. MyoD et BAF60C fournissent le «noyau» de protéines e complexeà marque le locus génomique de transcription qui procède à activer le programme myogénique squelettique. Les deux facteurs sont délivrés à des cellules par l'intermédiaire d'infections lentivirales et il est donc essentiel d'obtenir une haute efficacité d'infection de ces deux facteurs dans toutes les cellules. Ceci peut être réalisé à l'aide de virus de titre élevé ou des virus dotés de marqueurs de sélection. Les conditions de culture jouent également un rôle important dans l'optimisation de l'étendue de la différenciation myogénique. Nous vous proposons un protocole de différenciation à base de sérum pour la différenciation des cellules hES MyoD/BAF60C exprimant en grappes de précurseurs myogéniques, suivie d'une incubation dans un milieu défini sans sérum (contenant de l'insuline transferrine – STI) pour obtenir une conversion des précurseurs myogéniques en myotubes squelettiques. Cependant, il est possible que d'autres milieux définis peuvent réaliser une différenciation myogénique égale ou meilleure. Une limitation du courant du protocole est qu'il repose sur l'utilisation de sérum bovin foetal, qui contient en outrement de nombreuses protéines et des substances animales, montre des variations de lot à lot. Cela peut entraîner une moindre efficacité ou l'hétérogénéité de conversion myogénique dans myospheres. Fait à noter, toutes les structures EB-comme dérivées de CSEh BAF60/MyoD-expressing ne sont pas myospheres; à savoir, certains sont des agrégats EB-comme entièrement constitués de fibres musculaires. Le nombre de myospheres normalement dérivées de CSEh exprimant BAF60C et MyoD peut varier de 30 à 60% selon les estimations de coloration immunologique sur les sections EB effectuées à la fin du protocole (voir résultats). Une approche possible pour enrichir une boîte de culture pour seulement myospheres serait d'utiliser un journaliste myogénique. Cela faciliterait en rejetant les groupes EB-comme partiellement ou pas différenciées et ne sélectionnant que les myospheres.
Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux exigences temporelles des facteurs introduits serait utile d'améliorer la méthode de livraison. Par exemple, si BAF60C et MyoD ne sont nécessaires que pour shtemps ort à "kick" les cellules dans la bonne direction, les méthodes basées sur la livraison de l'ARNm modifié pourrait être appliquée. En revanche, si les facteurs sont nécessaires pour un temps plus long avant que les cellules exploiter leurs protéines endogènes, une approche épisomique serait recommandé d'éliminer la variabilité et des effets incontrôlés dus à l'intégration dans le génome. Enfin, nous notons qu'il est obligatoire d'exprimer BAF60C avant ou en même temps que MyoD (jamais après) afin de réaliser la conversion de CSEh dans les muscles squelettiques. L'exigence pour l'expression préalable de BAF60C repose vraisemblablement sur son rôle dans la pré-réglage du paysage épigénétique pour une bonne répartition de la chromatine à travers MyoD le génome 6,15. En tant que tel, les futurs protocoles pourraient être améliorées par des composés ou d'autres manipulations qui favorisent l'expression de BAF60C dans les CSEh.
The authors have nothing to disclose.
PLP est un chercheur associé du Centre de recherche en santé de Sanford enfants. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à PLP: R01AR056712, R01AR052779 et P30 AR061303 de l'Institut national de la santé / Institut national de l'arthrite et de l'appareil locomoteur et de Skin Diseases (NIAMS), MDA et Sanford enfants attribution recherche en santé. Ce travail a en partie bénéficié de financement de la recherche du septième programme-cadre de la Communauté européenne dans le projet FP7-santé – 2009 EndoStem 241440 (activation des cellules du système vasculaire associés souches et les cellules souches musculaires pour la réparation et l'entretien du tissu musculaire) SA a été soutenue par. CIRM bourse.
6 well plate | Corning | 3506 | |
6 well low attachment plate | Corning | 3471 | |
GFR Matrigel | BD Biosciencies | 356231 | |
MEFs (growth arrested)14 | |||
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | |
DMEM-F12 | Invitrogen | 15-090-CV | |
KOSR | Invitrogen | 10828-028 | |
1mM L-glutamine (100X) | Invitrogen | 35050-61 | |
Pen/Strep (100X) | Invitrogen | 15070-063 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-050 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | |
N2-supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
TrypLE express | Invitrogen | 12605-010 | |
FBS | HyClone | SH30396.03 | |
HS | Invitrogen | 16050114 | |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-100 | |
bfgf | Sigma | 4114-TC | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | |
Anti-MyoD | BD Biosciences | 554130 | |
Anti-MyHC | DSHB | MF20 | |
Anti-myogenin | DSHB | F5D |