Метод проницаемости от<em> Дрозофилы</em> Эмбрионы для анализов малых молекул деятельности
Summary
Введение малых молекул в развивающемся эмбрионе дрозофилы имеет большой потенциал для характеризующие биологическую активность новых соединений, наркотиков и токсинов, а также для зондирования основных путей развития. Методы, описанные здесь, наметить шаги, которые позволяют преодолеть естественные барьеры для такого подхода, расширение полезность модели дрозофилы эмбрионов.
Abstract
Drosophila эмбрион уже давно мощным лабораторная модель для выяснения молекулярно-генетических механизмов, которые управляют развитием. Легкость генетических манипуляций с этой модели вытеснил фармакологические подходы, которые широко распространен в других животных моделях и клеточных анализов. Здесь мы опишем последние достижения в протокол, который позволяет применение малых молекул в развивающиеся плодовой мушки эмбриона. Метод детали шаги для преодоления непроницаемости яичной скорлупы при сохранении жизнеспособности эмбриона. Eggshell пермеабилизации в широком диапазоне от стадии развития достигается за счет применения описанного ранее D-лимонен эмбриона проницаемости растворителя (EPS 1) и старения эмбрионов при пониженной температуре (18 ° C) до лечения. Кроме того, использование дальним красным красителем (Cy5) в качестве индикатора пермеабилизации описано, который совместим с последующих применений, включающих стандартный красный и зеленый гриппorescent красители в живых и фиксированных препаратах. Этот протокол применяется в исследованиях с использованием биологически активных соединений для исследования механизмов развития, а также для исследований, направленных на оценку тератогенным или фармакологическую активность неохарактеризованных малых молекул.
Introduction
Drosophila эмбрион продолжает оставаться одним из ведущих модель для исследования фундаментальных механизмов развития 2. Это мощная модель поддерживается широкий спектр молекулярно-генетических инструментов, которые позволяют манипуляции практически любого гена в любой момент времени и в любой развивающейся органа. Небольшой размер, быстрое развитие, а также обширные характеристика морфогенеза эмбриона дрозофилы сделать его модель выбора для генетических экранов, многие из которых раскрыты фундаментальные онтогенетических путей 3,4. Многочисленные фенотипы в зародыше дрозофилы были охарактеризованы и легко интерпретируемых, часто предоставляя средства идентификации основные молекулярные генетические механизмы, ответственные за ненормального признака.
Исторически сложилось так, недостатком модели эмбриона мухи была трудность введения небольших молекул для эмбриональных тканей. Это препятствие поставил ограничения на: 1) насING известные биологически активные малые молекулы в качестве зондов допросить механизмы развития и 2) с помощью этой сложившейся модели для оценки тератогенным или фармакологическую активность неохарактеризованных малых молекул. Как следствие, скрининг потенциал летучей эмбриона было недостаточно в характеристике активности малой молекулы.
Доставка малых молекул в летучей эмбриона может быть достигнуто с двумя способами: 1) проницаемости яичной скорлупы и 2) микроинъекции. В данной статье представлены авансы методом проницаемости, которые легко выполнить в условиях обычного Drosophila лаборатории. Следует отметить, что последние достижения в методах микроинъекций с микрофлюидики технологии также способствует способов введения соединений в эмбриона 5,6. Введение в молекулы эмбриона предотвращается восковым слоем скорлупы 7. Drosophila яичной скорлупы состоит из пяти слоев. Отнаизнанку они: желточной оболочки, восковой слой, внутренняя хорионический слой, endochorion и exochorion 8. Три внешних хориона слои могут быть удалены путем краткого всплытии эмбриона в разбавленной хлорной извести, шаг называют dechorionation. Подвергается восковой слой может затем быть нарушена под воздействием органических растворителей, таких как гептан и октан 7,9, что делает dechorionated эмбрион проницаемой, пока он остается заключен в основной желточной оболочки. Тем не менее, использование этих растворителей вводит осложнения из-за их токсичности и трудности в регулировании их решительные меры permeabilizing, оба из которых имеют сильнейшие негативные последствия для жизнеспособности эмбриона 9,10.
Способ проницаемости с использованием композиции называют эмбриона пермеабилизации растворитель (EPS) был описан ранее 1. Этот растворитель состоит из D-лимонен и растительного происхождения, поверхностно-активные вещества, которые позволяют растворитель быть misciblе с водных буферах. Низкая токсичность д-лимонен и способности разбавить растворителем в требуемой концентрации дала эффективный способ для генерации проницаемые эмбрионов с высокой жизнеспособности 1. Однако два эндогенные факторы по-прежнему приводить ограничения к применению. Во-первых, эмбрионы продемонстрировать неоднородность проницаемости после EPS лечения, даже когда осторожность, чтобы поддерживать тесные постановку развития. Во-вторых, эмбрионов старше примерно восьми часов доказали, трудно проницаемыми, в соответствии с упрочнения яичной скорлупы, которое происходит после откладки яиц 11.
Описанный здесь достижения в методе EPS, что: 1) содействие в выявлении и анализе почти одинаково проницаемыми эмбрионов, даже после фиксации и Иммуноокрашивание шаги были выполнены и 2) позволяют пермеабилизации эмбрионов на поздних развития временных точках (> 8 ч, этап 12 лет и старше). В частности, применение дальним красным красителем,Cy5 карбоновой кислоты, описано, что служит индикатором проницаемости, который сохраняется в эмбрионе во время разработки и после формальдегида фиксации. Кроме того, показано, что выращивание эмбрионов при 18 ° С сохраняет яичную скорлупу в чувствительной государства EPS, позволяя пермеабилизации поздних эмбрионов на стадии (стадий 12-16).
Эти достижения преодолеть ранее упомянутые ограничения в методологии EPS. Таким образом, эта программа будет оказывать следователям с помощью ввести небольшие молекулы, представляющие интерес для эмбриона на отдельные развития временных точках, сохраняя жизнеспособность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный выше метод описывает средства для получения жизнеспособных эмбрионов Drosophila, которые доступны для малых лечения молекулы через широкий диапазон развития. Этот метод вводит новый и простой вывод, что старение эмбрионов при 18 ° С позволяет пермеабилизации поздних эмбрион…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
