Geçirgenliği için bir yöntem<em> Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için> Embriyolar
Summary
Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.
Abstract
Drosophila embriyo uzun gelişimini kontrol moleküler ve genetik mekanizmaları ortaya çıkması için güçlü bir laboratuvar model olmuştur. Bu modelle genetik manipülasyon kolaylığı diğer hayvan modelleri ve hücre bazlı deneylerde olağan farmakolojik yaklaşımlar yerini almıştır. Burada gelişmekte olan meyve sineği embriyo küçük moleküllerin uygulama sağlayan bir protokol son gelişmeleri açıklar. Yöntem, embriyo canlılığını korurken kabuğunun geçirimsizliği aşmak için adımlar ayrıntıları. Gelişim aşamaları, geniş bir yelpazesinde Eggshell permeabilizasyon çözücü, daha önce tarif d-limonen embriyo nüfuziyet (1 EPS) uygulanmasıyla ve (18 ° C) daha önce uygulanan tedavilerin indirgenmiş sıcaklıkta yaşlanma embriyoların elde edilir. Buna ek olarak, bir permeabilizasyon göstergesi olarak bir uzak-kırmızı boya (CY5) kullanımı standart kırmızı, yeşil ve gribi kapsayan alt uygulamaları ile uyumlu olan, tarif edilmektedirCanlı ve sabit preparasyonlarda orescent boyalar. Bu protokol, gelişim mekanizmaları sonda olarak karakterize edilmemiş, küçük moleküllerin ya da teratojenik farmakolojik etkinliğini değerlendirmek amacıyla çalışmalar için biyoaktif bileşiklerin kullanılması çalışmaları için de geçerlidir.
Introduction
Drosophila embriyo gelişimi 2 temel mekanizmalarının araştırılması için bir ilk örnek olmaya devam ediyor. Bu güçlü model, herhangi bir zaman noktasında ve herhangi gelişen organ içinde esasen herhangi bir genin manipülasyonlara izin moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede tarafından desteklenmektedir. Drosophila embriyonun morfojenezinin küçük boyutlu, hızlı bir gelişme ve kapsamlı karakterizasyonu bu temel gelişimsel geçitler 3,4 ortaya birçoğu genetik ekranlar için seçim bir model olun. Drosophila embriyo çok sayıda fenotipleri özelliği ve kolay yorumlanabilir, genellikle anormal bir özellikten sorumlu yatan moleküler genetik mekanizmaları tanımlamak için bir araç temin edilmiştir.
Tarihsel olarak, uçucu embriyo modelinin bir eksiklik embriyonik dokular için küçük moleküller tanıtan zorlanmasıdır. 1) bize: Bu engel üzerine sınırlamalar poz vardırsondalar gelişimsel mekanizmaları sorgulamak ve 2) uncharacterized küçük moleküllerin teratojenik veya farmakolojik aktivitesini değerlendirmek için Kurulan bu modeli kullanarak olarak bilinen biyoaktif küçük moleküller ing. Bunun bir sonucu olarak, sinek embriyonun tarama olası küçük molekül aktivitesinin karakterizasyonu atıl edilmiştir.
Kabuğu 1) permeabilizasyon ve 2) mikroenjeksiyon: sinek embriyoya küçük moleküllerin teslim iki yöntem ile elde edilebilir. Bu makalede, bir Drosophila geleneksel laboratuar ortamında çalıştırmak kolay nüfuziyet yöntemine avans sunar. Bu teknoloji ile mikro-enjeksiyon ve arayüz yöntemlerinde son gelişmeler, aynı zamanda embriyo 5,6 bileşiklerin tanıtılması için yöntemler ile katkı olduğu not edilmelidir. Embriyoya molekülleri Tanıtımı kabuğu 7 bir yapışkan tabakası ile önlenir. Drosophila yumurta kabuğu beş tabakadan oluşur. Itibareniçten dışa bunlar: vitellin membran, mumsu tabaka, iç koryon tabakası, endochorion ve exochorion 8. Üç dış koryonik tabakalar seyreltik ağartıcı embriyonun kısa daldırma yoluyla kaldırılabilir bir adım Dechorionation olarak anılacaktır. Bu temel vitellin zar ile kaplı kalır maruz yapışkan katman daha sonra, geçirgen hale dechorionated embriyo gibi heptan ve oktan 7,9 gibi organik çözücüler, maruz bırakılarak tehlikeye girebilir. Bununla birlikte, bu çözücülerin kullanımı da toksisite ve embriyo canlılığı 9,10 Stark olumsuz etkileri vardır, her ikisi de güçlü su-geçirimli eylem düzenlenmesinde zorluğu nedeniyle komplikasyonlar getirmektedir.
Çözücü, bir bileşim olarak adlandırılan embriyo geçirgenliği (EPS) kullanılarak nüfuziyet için bir yöntem olup, daha önce tarif edildiği 1 olmuştur. Bu çözücü miscibl olmak için solvent olanak d-limonen ve bitki-türevi yüzey aktif maddeler oluşmaktadırSulu tampon maddeler ile örn. D-limonen ve arzu edilen konsantrasyonlara kadar çözücünün seyreltilmesi için yeteneğinin düşük toksisiteye yüksek canlılığı 1 ile geçirgen embriyolar oluşturmak için etkin bir yöntem vermiştir. Bununla birlikte, iki endojen faktör uygulamaya sınırlamalar getirmek için devam etmiştir. İlk olarak, embriyolar ilgilenmek kapatmak gelişimsel evreleme korumak için alındığında bile, EPS tedaviden sonra geçirgenliği heterojenite göstermektedir. İkincisi, yaklaşık sekiz saatten daha eski yumurta 11 döşeme sonra ortaya kabuğunun bir sertleşme ile tutarlı, geçirgenliği zor kanıtlanmıştır embriyolar.
Burada tarif EPS yönteminde gelişmeler bulunmaktadır: 1) sabitleme parçaları ve immüno-lekeleme adımlar yürütülür ve 2)> (geç gelişim zaman noktalarında, 8 saat, sahne embriyo geçirgenliği sağlayacak sonra bile, yakın aynı permeabilize embriyolar tanımlanması ve analiz yardımcı 12 ve üzeri). Spesifik olarak, bir uzak-kırmızı boya uygulanması,CY5 karboksilik asit, geliştirme sırasında ve formaldehit tespit sonrası embriyo devam geçirgenlik göstergesi olarak hizmet vermektedir tarif edilir. Buna ek olarak, 18 ° C 'de embriyolar yetiştirme geç dönem embriyo (aşamalar 12-16) geçirgenliği sağlayan, bir EPS hassas halde yumurtaların muhafaza gösterilmiştir.
Bu gelişmeler EPS metodoloji için daha önce sözü edilen sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu uygulama, bu nedenle canlılığını korurken farklı gelişim zaman noktalarında embriyo ilgilendiren küçük moleküller tanıtmak için bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki yöntem, geniş bir gelişim aralığında küçük molekül tedavileri için erişilebilir uygun bir Drosophila embriyoların elde edilmesi için bir yöntem açıklar. Bu yöntem daha önce sadece erken evre embriyolar görüldüğü gibi 18 ° C'de embriyolar yaşlanma aynı etkinlikte geç evre embriyoların geçirgenliği sağlayan yeni ve basit bulma tanıttı. Buna ek olarak, geçirgenlik göstergesi olarak uzak-kırmızı boya CY5 karboksilik asidin kullanımı sonrası düzeltme uygulam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
