Een methode van permeabilisatie van<em> Drosophila</em> Embryo's voor Testen van Small Molecule Activiteit
Summary
Introductie van kleine moleculen de ontwikkeling Drosophila embryo grote mogelijkheden voor het karakteriseren van biologische activiteit van nieuwe verbindingen, geneesmiddelen en toxinen en het tasten fundamentele ontwikkelingspaden. Werkwijzen hierin beschreven schetsen stappen natuurlijke barrières deze benadering overwonnen, het uitbreiden van de bruikbaarheid van de Drosophila embryo model.
Abstract
De Drosophila embryo is al lange tijd een krachtige laboratorium model voor het ophelderen van de moleculaire en genetische mechanismen die ontwikkeling te bepalen. Het gemak van genetische manipulatie met dit model farmacologische benaderingen die gemeengoed zijn in andere diermodellen en cel-gebaseerde testen verdrongen. Hier beschrijven we de recente ontwikkelingen in een protocol dat de toepassing van kleine moleculen in staat stelt om de zich ontwikkelende fruitvlieg embryo. De methode Gegevens stappen om de ondoordringbaarheid van de eierschaal weg te werken en levensvatbaarheid van het embryo. Eierschaal permeabilisatie in een breed scala van ontwikkelingsstadia wordt bereikt door toepassing van een eerder beschreven d-limoneen embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS 1) en door veroudering embryo's bij verlaagde temperatuur (18 ° C) voorafgaand aan behandelingen. Bovendien wordt het gebruik van een ver-rode kleurstof (CY5) als indicator permeabilisatie beschreven die geschikt downstream toepassingen waarbij standaard rode en groene grieporescent kleurstoffen in levende en vaste preparaten. Dit protocol is van toepassing op studies met bioactieve verbindingen ontwikkelingsmechanismen sonde en voor studies ter evaluatie teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen.
Introduction
De Drosophila embryo blijft een van de beste model voor onderzoek naar de fundamentele mechanismen van ontwikkeling 2 zijn. Deze krachtige model wordt ondersteund door een breed scala van moleculair genetische tools die manipulaties van in wezen elk gen toestaan op elk tijdstip en op elke ontwikkelen orgel. Het kleine formaat, snelle ontwikkeling, en uitgebreide karakterisering van morfogenese van de Drosophila embryo maken het een model van de keuze voor genetische screens, waarvan vele hebben blootgelegd fundamentele ontwikkelingstrajecten 3,4. Talrijke fenotypen in de Drosophila embryo zijn gekarakteriseerd en zijn gemakkelijk te interpreteren, vaak een middel om onderliggende moleculaire genetische mechanismen verantwoordelijk voor een abnormale eigenschap te identificeren.
Historisch gezien is een tekortkoming van de vlieg embryo model de moeilijkheid van de invoering van kleine moleculen om embryoweefsel geweest. Deze hindernis heeft beperkingen gesteld op: 1) using bekende bioactieve kleine moleculen als probes voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen ondervragen en 2) het gebruik van dit model vastgesteld op teratogene of farmacologische activiteit van ongekarakteriseerde kleine moleculen te evalueren. Bijgevolg heeft de screening mogelijk van de vlieg embryo onvoldoende benut in de karakterisering van moleculen activiteit.
Levering van kleine moleculen aan de vlieg embryo kan worden bereikt met twee methoden: 1) permeabilisatie van de eierschaal en 2) micro-injectie. Dit artikel presenteert voorschotten aan de methode van permeabilization die eenvoudig uit te voeren in de setting van een conventionele Drosophila laboratorium zijn. Opgemerkt zij dat de recente ontwikkelingen in micro-injectie methoden microfluïdische technologie ook bij aan werkwijzen voor het inbrengen verbindingen om de embryo 5,6. Introductie van moleculen aan het embryo wordt verhinderd door een waslaag van de eierschaal 7. De Drosophila eierschaal bestaat uit vijf lagen. Vanbinnen naar buiten zijn ze: de vitelline membraan, de waslaag, de binnenste laag chorion, de endochorion en de exochorion 8. De drie buitenste chorion lagen kunnen worden verwijderd door korte emersion van het embryo in verdund bleekwater, genoemde stap als dechorionation. De blootgestelde wasachtige laag kan vervolgens worden aangetast door blootstelling aan organische oplosmiddelen, zoals heptaan en octaan 7,9, waardoor de dechorionated embryo permeabel, maar blijft ingekapseld in de onderliggende vitelline membraan. Echter, het gebruik van deze oplosmiddelen introduceert complicaties vanwege hun toxiciteit en de moeilijkheid bij het reguleren van hun sterke permeabilisatie actie die beide sterk negatieve gevolgen embryouitvoerbaarheid 9,10.
Werkwijze voor permeabilisatie met een samenstelling genoemd embryo permeabilisatie oplosmiddel (EPS) is eerder beschreven 1. Dit oplosmiddel bestaat uit d-limoneen en planten-afgeleide oppervlakteactieve stoffen die het oplosmiddel in staat miscibl te zijne met waterige buffers. De lage toxiciteit van d-limoneen en het vermogen om het oplosmiddel te verdunnen tot de gewenste concentratie is een effectieve methode om permeabel embryo's met hoge levensvatbaarheid 1 genereren opgeleverd. Evenwel twee endogene factoren blijven beperkingen aan de toepassing brengen. Eerste, embryo's tonen heterogeniteit in permeabiliteit na een EPS-behandeling, zelfs wanneer zorg is genomen om dicht ontwikkelingsstoornissen enscenering te handhaven. Ten tweede, embryo ouder dan ongeveer acht uren zijn moeilijk te permeabiliseren, consistent met een verharding van de eierschaal die optreedt na eierleggende 11 bewezen.
Hier beschreven zijn vooruitgang in de EPS methode: 1) helpen bij het identificeren en analyseren van bijna identiek gepermeabiliseerde embryo, zelfs na fixatie en immunokleuring stappen zijn uitgevoerd en 2) mogelijk permeabilisatie van embryo's in de late ontwikkelings tijdstippen (> 8 uur, stadium 12 jaar en ouder). Met name de toepassing van een ver-rode kleurstof,CY5 carbonzuur, wordt beschreven dat dient als een indicator permeabiliteit, die blijft in het embryo tijdens de ontwikkeling en na formaldehyde fixatie. Bovendien wordt aangetoond dat opvoeding embryo bij 18 ° C houdt de schalen per EPS gevoelige toestand, waardoor permeabilisatie laat stadium embryo (stappen 12-16).
Deze vooruitgang overwinnen van de eerder genoemde beperkingen van de EPS methode. Deze toepassing zal daarom voorzien de onderzoekers een middel om kleine moleculen van belang kennismaken met de embryo in verschillende ontwikkelings tijdstippen behoud levensvatbaarheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bovenstaande methode schetst een middel tot het verkrijgen van levensvatbare Drosophila embryo's die toegankelijk is voor kleine molecule behandelingen in een breed scala ontwikkelingsstoornissen zijn. Deze methode introduceert de nieuwe en eenvoudige vaststelling dat veroudering embryo's bij 18 ° C maakt permeabilization van laat stadium embryo's met dezelfde werkzaamheid zoals eerder alleen gezien in een vroeg stadium embryo's. Bovendien is het gebruik van de ver-rode kleurstof CY5 carbonz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
