の透過方法<em>ショウジョウバエ</em小分子の活性のアッセイのための>胚
Summary
ショウジョウバエ胚への小分子の導入は、新規化合物、薬物、および毒素の生物学的活性を特徴づけるだけでなく、根本的な発生経路を探査するための大きな可能性を提供しています。本明細書に記載される方法は、 ショウジョウバエ胚モデルの有用性を拡大し、このアプローチには自然な障壁を克服する手順の概要を説明します。
Abstract
ショウジョウバエの胚は長い開発を制御する分子および遺伝的メカニズムを解明するための強力な実験室モデルとなっている。このモデルを使って遺伝子操作のしやすさは、他の動物モデルおよび細胞ベースのアッセイでは一般的である薬理学的アプローチを取っています。ここでは、開発ショウジョウバエ胚への小分子の適用を可能にするプロトコルの最近の進歩について説明します。この方法は、胚の生存率を維持しながら、卵殻の不透過性を克服するための手順を詳しく説明します。発達段階の幅広い卵殻の透過性は、溶媒、前述のd-リモネン胚透過化（1 EPS）を適用することによって、（18℃）の前治療に低温で加齢の胚によって達成される。また、透過性指標として遠赤色色素（CY5）の使用は、標準的な赤と緑のインフルエンザを含む下流のアプリケーションとの互換性がある、記載されているライブや固定製剤におけるorescent染料。このプロトコルは、特徴づけられていない小分子の催奇形性や薬理活性を評価することを目的とした研究のための発達のメカニズムを探るだけでなく、生物活性化合物を用いた研究にも適用可能である。
Introduction
ショウジョウバエの胚は、開発2の基本的なメカニズムの調査のための最高のモデルであり続けている。この強力なモデルは、任意の時点で、任意の開発器官内、基本的に任意の遺伝子の操作を可能にする分子遺伝学的ツールの幅広いサポートされています。 ショウジョウバエの胚の形態形成の小型化、急速な発展、および大規模な特性評価が基本的な発生経路を3,4発見されているその多くは遺伝子スクリーニングのための選択のモデルにする。 ショウジョウバエ胚の多数の表現型が特徴づけられ、容易に解釈され、多くの場合、異常な形質の責任を根本的な分子遺伝的メカニズムを識別するための手段を提供してきました。
歴史的には、フライ胚モデルの欠点は、胚組織に小分子を導入することの難しさとなっている。 1）私たち：この障害は、上の制限を提起している発達メカニズムおよび2を尋問するプローブとして、既知の生物活性小分子をING）特徴付けられていない小分子の催奇形性または薬理学的活性を評価するために、この確立されたモデルを使用して。その結果、ハエの胚のスクリーニング電位は、小分子活性の特徴付けに十分に活用されている。
1）卵殻の透過処理および2）マイクロインジェクション：ハエ胚への小分子の送達は、2の方法で達成することができる。この記事では、従来のショウジョウバエの実験室の設定で実行しやすい透過処理する方法にも進歩を提示します。これは、マイクロフルイディクス技術とマイクロインジェクション法の最近の進歩にも胚5,6に化合物を導入する方法に貢献していることに留意すべきである。胚への分子の導入は卵殻7のワックス状の層によって防止される。 ショウジョウバエ卵殻は5層からなる。からインサイドアウト、彼らは以下のとおりです。卵黄膜、ろう状層、内側の絨毛層、endochorionとexochorion 8。 3個の外絨毛膜層を希漂白剤、dechorionationと呼ぶ工程における胚の簡単な出現によって除去することができる。それは、基礎となる卵黄膜に包まれたままで露出蝋質層は、透過性の絨毛膜を除去し、胚をレンダリングする、例えばヘプタン、オクタン7,9などの有機溶媒への暴露によって損なわれ得る。しかしながら、これらの溶媒の使用は、胚の生存率9,10に厳しい負の効果を有し、どちらもそれらの毒性、それらの強力な浸透化作用を調節する上での困難に起因する合併症を導入する。
溶媒組成物と呼ばれる胚の透過化（EPS）を用いて透過化する方法は、以前に1に記載されている。この溶剤はmisciblする溶媒を有効にd-リモネンおよび植物由来の界面活性剤で構成されています水性緩衝液を使用して電子。 d-リモネンおよび所望の濃度に溶剤を希釈する能力の低毒性は高い生存1と透過性の胚を生成するための効果的な方法が得られている。しかし、2内因性の要因が、アプリケーションに制限を持って続けてきました。まず、胚は注意が近い発達ステージングを維持するために取られた場合でも、EPS処理後の透過性の不均一性を実証する。第二に、約8時間以上経過した胚は、卵が11を敷設した後に発生する卵殻の硬化と一致して、透過性にすることは困難であることが判明している。
ここで説明したEPS法の進歩は、1）固定と免疫染色の手順が実行され、2）>（遅発育の時点で8時間、ステージの胚の透過を可能にされた後でも、ほぼ同じように透過化胚を特定し、分析するのに役立つ12歳以上）。具体的には、遠赤色色素の適用、CY5カルボン酸は、開発中およびホルムアルデヒド固定後胚における持続透過性インジケータとして機能することが記載されている。加えて、18℃で胚を飼育すると、後期段階の胚（ステージ12〜16）の透過を可能にする、EPS敏感な状態で卵殻を維持することが示されている。
これらの進歩は、EPS方法論に前述の制限を克服する。このアプリケーションは、従って、生存率を維持しながら、異なる発達時点で胚にとって関心のある小分子を導入するための手段を研究者に提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の方法は、広い範囲に渡って発達する小分子治療にアクセス可能な実行可能なショウジョウバエの胚を得るための手段の概要を説明します。この方法は、18℃で胚を高齢化、新規で簡単な調査結果を紹介し、以前は初期胚で見られるのと同じ効力を有する後期胚の透過を可能にします。また、透過性の指標として遠赤色色素CY5カルボン酸の使用は、接尾用途において有効であるこ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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