Un método de permeabilización de<em> Drosophila</em> Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad
Summary
Introducción de pequeñas moléculas para el desarrollo de embrión de Drosophila ofrece un gran potencial para la caracterización de la actividad biológica de nuevos compuestos, fármacos y toxinas, así como para sondear las vías fundamentales de desarrollo. Los métodos descritos en este documento describen los pasos que superan las barreras naturales de este enfoque, la ampliación de la utilidad del modelo de embrión de Drosophila.
Abstract
El embrión de Drosophila ha sido durante mucho tiempo un modelo de laboratorio de gran alcance para dilucidar los mecanismos moleculares y genéticos que controlan el desarrollo. La facilidad de manipulaciones genéticas con este modelo ha suplantado enfoques farmacológicos que son comunes en otros modelos animales y ensayos basados en células. A continuación se describe los recientes avances en un protocolo que permite la aplicación de pequeñas moléculas a la fruta en desarrollo embrión de la mosca. El método de detalles de medidas para superar la impermeabilidad de la cáscara del huevo, mientras que el mantenimiento de la viabilidad del embrión. Cáscara de huevo de permeabilización a través de una amplia gama de etapas de desarrollo se logra por aplicación de un d-limoneno embrión permeabilización descrito anteriormente disolvente (EPS 1) y por el envejecimiento de los embriones a temperatura reducida (18 ° C) antes de los tratamientos. Además, se describe el uso de un colorante rojo lejano (Cy5) como un indicador de la permeabilización, que es compatible con aplicaciones posteriores que implican estándar gripe rojo y verdecolorantes orescent en preparados en vivo y fijos. Este protocolo es aplicable a los estudios que utilizan compuestos bioactivos para investigar los mecanismos de desarrollo, así como para los estudios dirigidos a evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizadas.
Introduction
El embrión de Drosophila sigue siendo un modelo principal de investigación de los mecanismos fundamentales del desarrollo 2. Este poderoso modelo se apoya en una amplia gama de herramientas de genética molecular que permiten la manipulación de prácticamente cualquier gen en cualquier punto del tiempo y dentro de cualquier órgano en desarrollo. El pequeño tamaño, el rápido desarrollo, y una amplia caracterización de la morfogénesis del embrión de Drosophila lo convierten en un modelo de elección para las pantallas de genética, muchos de los cuales han descubierto vías fundamentales de desarrollo 3,4. Numerosos fenotipos en el embrión de Drosophila han sido caracterizados y son fáciles de interpretar, a menudo proporcionando un medio para identificar los mecanismos genéticos moleculares subyacentes responsables de un rasgo anormal.
Históricamente, una deficiencia del modelo de embrión de la mosca ha sido la dificultad de la introducción de pequeñas moléculas a tejidos embrionarios. Este obstáculo ha planteado limitaciones sobre: 1) nosción conocidas pequeñas moléculas bioactivas como sondas para interrogar a los mecanismos de desarrollo y 2) el uso de este modelo establecido para evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizados. Como consecuencia, el potencial de detección de la embrión de la mosca se ha infrautilizado en la caracterización de pequeña molécula de la actividad.
Entrega de pequeñas moléculas para el embrión de la mosca se puede lograr con dos métodos: 1) permeabilización de la cáscara de huevo y 2) de microinyección. Este artículo presenta los avances en el método de permeabilización que son fáciles de ejecutar en el entorno de un laboratorio de Drosophila convencional. Cabe señalar que los recientes avances en los métodos de microinyección con tecnología de microfluidos también está contribuyendo a los métodos de introducción de compuestos en el 5,6 embrión. La introducción de moléculas para el embrión es impedido por una capa cerosa de la cáscara del huevo 7. La cáscara de los huevos de Drosophila se compone de cinco capas. Desdeadentro hacia afuera son: la membrana vitelina, la capa cerosa, la capa coriónica interior, el endochorion y la exocorion 8. Las tres capas coriónicas exteriores se pueden eliminar mediante una breve inmersión del embrión en lejía diluida, un paso conoce como dechorionation. La capa cerosa expuesta puede entonces verse comprometida por la exposición a disolventes orgánicos, tales como heptano y octano 7,9, haciendo que el embrión dechorionated permeable, mientras que permanece encerrado en la membrana vitelina subyacente. Sin embargo, el uso de estos disolventes introduce complicaciones debido a su toxicidad y la dificultad en la regulación de su fuerte acción permeabilizante, ambos de los cuales tienen efectos negativos sobre Stark 9,10 viabilidad de los embriones.
Un método de permeabilización utilizando una composición denomina embrión permeabilización de disolvente (EPS) ha sido previamente descrito 1. Este disolvente consiste en tensioactivos d-limoneno y derivados de las plantas que permiten que el disolvente sea misciblE con tampones acuosos. La baja toxicidad de d-limoneno y la capacidad para diluir el disolvente a concentraciones deseadas ha producido un método eficaz para generar embriones permeables con alta viabilidad 1. Sin embargo, dos factores endógenos han continuado para llevar limitaciones a la aplicación. En primer lugar, los embriones demuestran la heterogeneidad de la permeabilidad después del tratamiento de EPS, incluso cuando se tiene cuidado de mantener la estadificación del desarrollo de cerca. En segundo lugar, los embriones mayores de aproximadamente ocho horas han demostrado ser difícil para permeabilizar, consistente con un endurecimiento de la cáscara del huevo que se produce después de la puesta de huevos 11.
Descrito aquí están los avances en el método de EPS que: 1) ayudar en la identificación y el análisis de los embriones casi idénticamente permeabilizadas, incluso después de las etapas de fijación y inmunoticción se han ejecutado y 2) permiten la permeabilización de los embriones en los puntos de tiempo de desarrollo tardías (> 8 horas, el escenario 12 años o más). Específicamente, la aplicación de un colorante rojo lejano,Ácido carboxílico Cy5, se describe que sirve como un indicador de la permeabilidad, que persiste en el embrión durante el desarrollo y después de la fijación de formaldehído. Además, se muestra que la cría de los embriones a los 18 ° C mantiene la cáscara del huevo en un estado sensible EPS, lo que permite la permeabilización de los embriones de etapa tardía (etapas 12-16).
Estos avances superan las limitaciones mencionadas anteriormente en la metodología EPS. Por tanto, esta aplicación proporcionará a los investigadores una manera de introducir pequeñas moléculas de interés para el embrión en puntos de tiempo de desarrollo distintas, manteniendo la viabilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método anterior describe un medio para la obtención de embriones de Drosophila viables que sean accesibles a los pequeños tratamientos de moléculas a través de una amplia gama de desarrollo. Este método introduce el nuevo hallazgo y simple que el envejecimiento de los embriones a 18 º C permite la permeabilización de embriones de etapa tardía con la misma eficacia que visto previamente sólo en embriones en etapa temprana. Además, el uso de la Cy5 tinte ácido carboxílico rojo lejano como un indic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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