Une méthode de perméabilisation de<em> Drosophila</em> Embryons pour dosages de petites molécules activité
Summary
Introduction de petites molécules à l'embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l'activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l'expansion de l'utilité du modèle de l'embryon de drosophile.
Abstract
L'embryon de drosophile a longtemps été un modèle de laboratoire puissant pour élucider les mécanismes moléculaires et génétiques qui contrôlent le développement. La facilité de manipulations génétiques avec ce modèle a supplanté les approches pharmacologiques qui sont monnaie courante dans d'autres modèles animaux et les tests cellulaires. Nous décrivons ici des progrès récents dans un protocole qui permet l'application de petites molécules à la mouche des fruits en développement embryonnaire. La méthode détails des mesures pour surmonter l'imperméabilité de la coquille tout en maintenant la viabilité des embryons. Coquille d'oeuf perméabilisation dans un large éventail de stades de développement est réalisée par application d'un embryon précédemment décrit d-limonène solvant perméabilisation (EPS 1) et par le vieillissement des embryons à température réduite (18 ° C) avant les traitements. En outre, on utilise un colorant rouge lointain (CY5) en tant qu'indicateur de perméabilisation est décrite, ce qui est compatible avec des applications en aval impliquant grippe rouge et vert standardcolorants orescent dans des préparations en direct et fixes. Ce protocole est applicable à des études utilisant des composés bioactifs pour sonder les mécanismes de développement ainsi que pour des études visant à évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés.
Introduction
L'embryon de drosophile continue d'être un modèle de choix pour l'étude des mécanismes fondamentaux du développement 2. Ce modèle puissant est supporté par un large éventail d'outils génétiques moléculaires qui permettent des manipulations de quasiment n'importe quel gène à n'importe quel point dans le temps et dans le développement de n'importe quel organe. La petite taille, le développement rapide et une caractérisation de la morphogenèse de l'embryon de drosophile en font un modèle de choix pour les écrans génétiques, dont beaucoup ont découvert voies fondamentales de développement 3,4. De nombreux phénotypes dans l'embryon de drosophile ont été caractérisés et sont facilement interprétables, offrant souvent un moyen d'identifier les mécanismes génétiques moléculaires sous-jacents responsables d'un trait anormal.
Par le passé, un inconvénient du modèle d'embryon de mouche a été la difficulté d'introduire de petites molécules à des tissus embryonnaires. Cet obstacle a posé des limites à: 1) nousment connus petites molécules bioactives comme sondes d'interroger les mécanismes de développement et 2) l'utilisation de ce modèle mis en place pour évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés. En conséquence, le potentiel de dépistage de l'embryon de mouche a été sous-utilisé dans la caractérisation de l'activité de petites molécules.
Livraison de petites molécules à l'embryon à la mouche peut être réalisé selon deux méthodes: 1) perméabilisation de la coquille d'oeuf et 2) la micro-injection. Cet article présente les progrès de la méthode de perméabilisation qui sont faciles à exécuter dans le cadre d'un laboratoire de Drosophila classique. Il convient de noter que les progrès récents dans les méthodes de micro-injection avec la technologie microfluidique contribue également à des méthodes d'introduction de composés de 5,6 sur l'embryon. Introduire des molécules de l'embryon est empêché par une couche de cire de la coquille 7. La coquille drosophile se compose de cinq couches. À partir del'intérieur vers l'extérieur, ils sont: la membrane vitelline, la couche de cire, la couche intérieure chorionique, la endochorion et la exochorion 8. Les trois couches choriales extérieures peuvent être éliminées par une brève émersion de l'embryon dans la javel, une étape appelée dechorionation. La couche cireuse exposé peut ensuite être compromise par l'exposition à des solvants organiques, tels que l'heptane et l'octane 7,9, ce qui rend l'embryon dechorionated perméable, alors qu'il reste enfermé dans la membrane vitelline sous-jacent. Cependant, l'utilisation de ces solvants introduit des complications en raison de leur toxicité et de la difficulté à réglementer leur action de perméabilisation forte, qui ont tous deux des effets négatifs sur la viabilité des embryons Stark 9,10.
Une méthode de perméabilisation utilisant une composition appelé embryon perméabilisation solvant (EPS) a été décrit précédemment 1. Ce solvant est constitué de d-limonène et les tensioactifs d'origine végétale qui permettent au solvant d'être miscible avec des tampons aqueux. La faible toxicité du d-limonène et de la capacité de diluer le solvant à des concentrations désirées a donné une méthode efficace pour générer des embryons perméables avec une viabilité élevée. Cependant, deux facteurs endogènes ont continué à apporter des limitations à l'application. Tout d'abord, les embryons montrent l'hétérogénéité de la perméabilité après le traitement EPS, même lorsque l'on prend soin de maintenir la mise en scène de développement à proximité. Deuxièmement, des embryons âgés de plus de huit heures environ se sont avérés difficiles à perméabiliser, conformément à un durcissement de la coquille qui se produit après la ponte 11.
Décrit ici sont les progrès de la méthode EPS que: 1) aider à identifier et analyser les embryons quasi-identique perméabilisées, même après fixation et immunomarquage étapes ont été exécutées et 2) permettre la perméabilisation des embryons à la fin des points de temps de développement (> 8 h, stade 12 ans et plus). Plus précisément, l'application d'un colorant rouge lointain,CY5 acide carboxylique, est décrite qui sert d'indicateur de la perméabilité, qui persiste dans l'embryon au cours du développement et de formaldéhyde, après fixation. En outre, il est démontré que l'élevage des embryons à 18 ° C maintient la coquille dans un état sensible EPS, permettant perméabilisation des embryons à un stade avancé (stades 12-16).
Ces progrès surmonter les limitations mentionnées ci-dessus à la méthodologie des EPS. Cette application va donc fournir aux enquêteurs un moyen d'introduire de petites molécules d'intérêt à l'embryon à des moments distincts de développement tout en maintenant la viabilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé ci-dessus décrit un moyen d'obtenir des embryons de drosophile viables qui sont accessibles aux petits soins de molécules dans un large éventail de développement. Cette méthode présente le roman et simple constatation que le vieillissement des embryons à 18 ° C permet la perméabilisation des embryons à un stade avancé avec la même efficacité que vu précédemment que dans les embryons à un stade précoce. En outre, l'utilisation de la CY5 colorant rouge lointain acide carboxyl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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