שיטה של permeabilization של<em> דרוזופילה</em> עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות
Summary
מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.
Abstract
עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.
Introduction
עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה.
מבחינה היסטורית, חסרון של מודל עובר הזבוב היה הקושי בהחדרת מולקולות קטנות לרקמות עובריים. מכשול זה מציב מגבלות על: 1)ing מולקולות קטנות ביו ידועות כמו בדיקות לחקור את מנגנוני התפתחות ו2) שימוש במודל שהוקם זה כדי להעריך פעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized. כתוצאה מכך, פוטנציאל ההקרנה של עובר הזבוב כבר לא מנוצל באפיון של פעילות מולקולה קטנה.
משלוח של מולקולות קטנות לעובר הזבוב יכול להיות מושגת בשתי שיטות: 1) permeabilization של קליפת הביצה ו2) microinjection. מאמר זה מציג התקדמות לשיטה של permeabilization, כי הם קלים לביצוע בהגדרה של מעבדה דרוזופילה קונבנציונלית. יצוין, כי ההתקדמות בשיטות microinjection עם טכנולוגית מיקרופלואידיקה תורמת גם היא לשיטות של החדרת תרכובות ל5,6 העובר. היכרות עם מולקולות לעובר הוא למנוע על ידי שכבת שעווה של קליפת הביצה 7. קליפת הביצה דרוזופילה מורכבת מחמש שכבות. מןמבפנים החוצה הם: קרום vitelline, שכבת השעווה, שכבת כוריוני הפנימית, endochorion וexochorion 8. שלוש שכבות כוריוני חיצוניות ניתן להסיר על ידי emersion הקצר של העובר באקונומיקה מהולה, צעד המכונה dechorionation. שכבת השעווה נחשפה אז יכולה להיות בסכנה כתוצאה מחשיפה לממסים אורגניים, כגון heptane ויוקטן 7,9, טיוח את עובר dechorionated חדיר, בזמן שהוא נשאר עטוף בקרום vitelline הבסיסי. עם זאת, שימוש בממסים אלה מציג סיבוכים בשל רעילותם ואת הקושי בויסות פעולתם החזקה permeabilizing, אשר שניהם יש השפעות שליליות מוחלטת על 9,10 כדאיות עובר.
שיטה של permeabilization באמצעות permeabilization עובר הרכב כינה ממס (EPS) כבר תיארתי בעבר 1. ממס זה מורכב מחומרים פעילי שטח D-limonene וצמחי המאפשרים הממס להיות misciblE עם מאגרים מימיים. הרעילות הנמוכה של d-limonene והיכולת לדלל את הממס לריכוזים רצויים הניבה שיטה יעילה ליצירת עוברים חדירים עם כדאיות גבוהה 1. עם זאת, שני גורמים אנדוגני המשיכו להביא מגבלות ליישום. ראשית, עוברים להפגין את ההטרוגניות בחדירות לאחר טיפול EPS, גם כאשר הטיפול נלקח כדי לשמור על היערכות התפתחותיים קרובה. שנית, עוברים מבוגרים יותר משמונה שעות כ הוכיחו קשה permeabilize, עולה בקנה אחד עם התקשות של קליפת הביצה שמתרחשת לאחר הטלת הביצים 11.
שתואר כאן הן התקדמות בשיטת EPS כי: 1) לסייע בזיהוי וניתוח עוברי permeabilized כמעט זהה, גם לאחר צעדי הקיבעון וimmunostaining הוצאו להורג ו2) לאפשר permeabilization של עוברים בנקודות זמן התפתחותיים מאוחרות (> 8 שעות, שלב 12 ומעלה). באופן ספציפי, יישום של צבע מרחיק אדום,חומצה קרבוקסילית Cy5, מתוארת המשמשת כמחוון חדירות, שנמשך בעובר במהלך התפתחות ולאחר קיבוע פורמלדהיד. בנוסף, הוא הראה כי גידול עובר ב18 ° C שומר על קליפת הביצה במצב רגיש EPS, המאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר (שלבי 12-16).
מקדמות אלה להתגבר על המגבלות שהוזכרו קודם לכן למתודולוגיה EPS. יישום זה ולכן יספק לחוקרי אמצעי להציג את המולקולות קטנות של עניין לעובר בנקודות זמן התפתחותיים שונים, תוך שמירה על כדאיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה הנ"ל מתארת אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH/NIEHS R03ES021581 (awarded to M.D.R.) and by the University of Rochester Environmental Health Center (NIH/NIEHS P30 ES001247).
Materials
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu, J., Reinitz, Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M. Permeabilization of Drosophila eggs. Developmental biology. 35, 382-387 (1973).
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
