ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم
Summary
الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في المختبر.
Abstract
الخلايا الآكلة هي الخلايا المتخصصة جدا التي هي مستمدة من النسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظام. قدرة فريدة ليرتشف كل من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام يعني أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم إعادة الهيكل العظمي. معا، وبانيات الآكلة هي المسؤولة عن عملية الربط الديناميكية التي تنطوي على حد سواء ارتشاف العظام وتكوين العظام تعمل معا للحفاظ على الهيكل العظمي العادي أثناء الصحة والمرض.
كما أن خلايا العظام resorbing الرئيسية في الجسم، ويمكن التغيرات في التفريق ناقضة العظم أو وظيفة يؤدي إلى آثار عميقة في الجسم. الأمراض المرتبطة ظيفة ناقضة العظم المتغيرة يمكن أن تتراوح في شدتها من أمراض حديثي الولادة قاتلة بسبب الفشل في تشكيل الفضاء لنخاع الدم، لاحظ أكثر شيوعا الأمراض مثل هشاشة العظام، والتي المفرط ارتشاف العظم ناقضة العظم يهيئ لكسر تشكيل.
وقد سمح الأنف والحنجرة "> القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في المختبر لتقدم كبير في فهم دورة إعادة تشكيل العظام ومهدت الطريق لاكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة أن مكافحة هذه الأمراض.هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل وزراعة الخلايا الآكلة من نخاع العظم الماوس التي من شأنها أن تسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة.
Introduction
إعادة تشكيل العظام هو دينامية وينطوي على اقتران تكوين العظام مع ارتشاف العظم 1. هذه العملية للتنظيم محكم مسؤولة عن الحفاظ على الهيكل العظمي خلال التوازن الطبيعي، وردا على الاصابة والمرض.
الخلايا الآكلة هي الخلايا متعددة النوى الفريدة القادرة على resorbing كلا من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام. وتستمد الخلايا الآكلة من نسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظم 2-5. تشوهات في وظيفة أو تشكيل الخلايا الآكلة يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض السريرية، بما في ذلك الحالات الشائعة مثل مرض هشاشة العظام.
وقد سمح القدرة على توليد الخلايا الآكلة في المختبر لتقدما كبيرا في فهمنا للبيولوجيا العظام 6. ونتيجة لذلك، عوامل علاجية جديدة آخذة في الظهور لعلاج الأمراض المرتبطة ناقضة العظم المسؤولة عن الحالات المرضية والوفيات كبيرة 7 </sتصل>. صيانة التماثل الساكن من كتلة العظام وقوتها تتطلب اتخاذ إجراءات متضافرة من بانيات تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام 8،9. يتم تبديل التوازن العظام في عدد من الأمراض، بما في ذلك مرحلة ما بعد انقطاع الطمث وهشاشة العظام، والتي زاد النشاط ناقضة العظم يؤدي إلى فقدان المسببة للأمراض من كتلة العظام وكثافتها 10. مع زيادة توافر نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الأمراض التي تصيب البشر، هناك المزيد من الفرص لفك دور الخلايا الآكلة في أمراض العظام البشرية 11-13.
ويبدو أن العديد من البروتوكولات لتقنيات زراعة ناقضة العظم في الأدب، مع العديد من الاختلافات وصفت 9،12،14. ووصف زملاء شينغ منهجية مماثلة لبروتوكول المبينة أدناه، في وصفها للفحوصات osteoclastogenic من خلايا نخاع العظام في الفئران. لكن للافراج عن خلايا نخاع العظام العظام الطويلة بعد الحصاد، شينغ وآخرون مسح تجويف نخاع مع α-MEM وسائل الإعلام كاملة14. Catalfamo يدرس تأثير ارتفاع السكر في الدم على وظيفة ناقضة العظم ويصف الطريقة التي حشدت من قبل جميع الخلايا نخاع العظم التنظيف ومثقف لمدة 24 ساعة، وعند هذه النقطة يتم تجاهل الخلايا غير ملتصقة 12، وهي تقنية تستخدم أيضا من قبل بويل وآخرون 9 هذه البروتوكولات نشرت سابقا تتطلب ممارسة بيغ نخاع العظام، وهي ممارسة شاقة، الذي يدخل أيضا من خطر الإصابة إبرة عصا وفقدان نخاع العظم قيمة، كما لا بد من قطع طرفي العظم. البروتوكول، الذي وصفنا، بتطبيق استخدام هاون ومدقة لعزل الخلايا الآكلة، وهي مشابهة لطريقة عزل بلعم صفها Weischenfeldt وآخرون (15).
تجربتنا، ومع ذلك، هو أن العزلة ناقضة العظم والثقافة في المختبر باستخدام تقنيات النتائج المنشورة سابقا في نتائج متفاوتة من حيث الإنتاج ناقضة العظم، مما يؤدي في كثير من الأحيانفي عدم القدرة على زراعة الخلايا الآكلة. لذا، قمنا بوضع البروتوكول الذي يسمح لعزل متسقة من نخاع العظم لإنتاج الماوس أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى في المختبر، مع العائد التقريبي 70-80٪ من خلايا مطلي في البداية تشكيل الضامة والخلايا الآكلة في وقت لاحق، في حضور ناقضة العظم وسائل الإعلام تحريض.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت القدرة على عزل بسهولة وزراعة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر مسؤولا عن المساعدة على تعزيز فهم البيولوجيا العظام والأمراض بوساطة ناقضة العظم. كان تحديد RANKL التي تؤدي إلى هذا، عندما تم التعرف عليه مؤخرا كمنظم رئيسي لتشكيل ناقضة العظم، والتمايز وال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DE021683، R01 DE019434، U01 HL099776، مؤسسة ومختبر أوك Hagey للأطفال الطب التجديدي.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
