גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם
Summary
Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.
Abstract
Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים שנובעים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח העצם. היכולת הייחודית שלהם לנספגות שוב שני מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם משמעות הדבר היא כי הם משחקים תפקיד מפתח בויסות שיפוץ שלד. יחד, osteoblasts וosteoclasts אחראים לתהליך הצימוד הדינמי שכולל גם ספיגת עצם ויצירת עצם פועלת יחד כדי לשמור על השלד הנורמלי במהלך מחלה ובריאות.
כתא resorbing-העצם העיקרי בגוף, שינויים בבידול האוסטאוקלסטים או פונקציה יכולים לגרום להשפעה עמוקה בגוף. מחלות הקשורות לתפקוד האוסטאוקלסטים שינה יכולים טווח חומרת מחלה בילוד קטלנית עקב אי ליצור חלל מוח לhematopoiesis, לנצפתה יותר בכינוי פתולוגיות כגון אוסטאופורוזיס, שבו ספיגת עצם osteoclastic מוגזמת לתשומה כדי לשבר היווצרות.
אף אוזן גרון "> יכולת לבודד osteoclasts במספרים גבוהים במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של מחזור שיפוץ עצם וסללה את הדרך לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שמאבק במחלות אלו.כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולטפח osteoclasts ממח העצם של עכבר שיניב מספר גדול של osteoclasts.
Introduction
שיפוץ עצם הוא דינמי וכרוך בצימוד של יצירת עצם עם ספיגת עצם 1. תהליך חוזקה מוסדר זו הוא אחראי לשמירה על השלד במהלך הומאוסטזיס נורמלי, ובתגובה לפציעה ומחלה.
Osteoclasts הם תאים ייחודיים, multinucleated המסוגלים resorbing שתי מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם. Osteoclasts נגזרים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח עצם 2-5. ליקויים בתפקוד או ההיווצרות של osteoclasts יכולים לגרום למגוון רחב של פתולוגיות קליניות, כוללים מצבים שכיחים כמו אוסטאופורוזיס.
היכולת ליצור osteoclasts במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה עצם 6. כתוצאה מכך, סוכנים טיפוליים חדשים צצים לטיפול במחלות הקשורות להאוסטאוקלסטים אשר אחראים על תחלואות ותמותה משמעותיות של 7 </sעד>. תחזוקת homeostatic של מסת עצם וכוח דורשת פעולה מתואמת של osteoblasts יוצרי העצם וosteoclasts resorbing עצם 8,9. הומאוסטזיס העצם משתנה במספר המחלות, כוללים אוסטאופורוזיס לאחר גיל מעבר, שבו פעילות מוגברת האוסטאוקלסטים מובילה לאובדן פתוגניים של מסת עצם וצפיפות 10. עם עלייה בזמינות של דגמים עכבריים מהונדסים של מחלות בבני אדם, יש יותר הזדמנות לפענח את התפקיד של osteoclasts במחלת עצם אנושי 11-13.
פרוטוקולים רבים לטכניקות culturing האוסטאוקלסטים מופיעים בספרות, בוריאציות רבות תיארו 9,12,14. Xing ועמיתיו מתארים שיטה דומה לפרוטוקול מתואר להלן, בתיאורם של מבחני osteoclastogenic מתאי מח עצם עכבריים. עם זאת כדי לשחרר את תאי מח העצם הבאים קציר עצם ארוך, Xing לשטוף et al. העצם חלול בתקשורת מלאה α ממ14. Catalfamo בוחן את ההשפעה של היפרגליקמיה על תפקוד האוסטאוקלסטים ומתאר שיטה שבה כל התאים מגויסים על ידי שטיפת מוח עצם בתרבית למשך 24 שעות, ובנקודה שאינם חסיד התאים מבוטלים 12, טכניקה המשמשת גם על ידי בויל אח ' . 9 פרוטוקולים שפורסמו בעבר אלה מחייבים את הנוהג של שטיפת מוח העצם, תרגול מייגע, שגם מציג את הסיכון לפגיעת מחט מקל ואובדן מח עצם יקר, כאחד חייב לחתוך את שני הקצוות של העצם. הפרוטוקול, שאנו מתארים, מיישם את השימוש במכתש ועלי כדי לבודד osteoclasts, שהוא דומה לשיטה של בידוד מקרופאג שתואר על ידי et Weischenfeldt אל. 15
הניסיון שלנו, לעומת זאת, הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאהבחוסר יכולת לטפח osteoclasts. לכן, אנו פיתחנו פרוטוקול המאפשר לבידוד העקבי של מח עצם עכבר כדי לייצר מספר גדול של osteoclasts multinucleated במבחנה, עם תשואה של כ 70-80% מתאים בתחילה מצופים יוצר מקרופאגים ולאחר מכן osteoclasts, בנוכחות תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יכולת לבודד בקלות ולטפח מספר גדול של osteoclasts במבחנה הייתה אחראית על סיוע לקידום הבנה של ביולוגיה עצם ומחלות תיווך האוסטאוקלסטים. זה היה זיהוי של RANKL שיובילו לכך, בעת שזוהה לאחרונה כרגולטור העיקרי של היווצרות האוסטאוקלסטים, בידול והישרדות 16-18.
<p class="jove_content"…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את התמיכה של מענקי NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, קרן Oak והמעבדה Hagey לילדי רפואת רגנרטיבית.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
