Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow
Summary
Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.
Abstract
Osteoclasten zijn zeer gespecialiseerde cellen die zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg. Hun unieke capaciteit om zowel de organische als anorganische matrices bot resorberen betekent dat zij een belangrijke rol in de regulering skelet remodeling. Samen osteoblasten en osteoclasten zijn verantwoordelijk voor het dynamisch koppelen proces dat zowel botresorptie en botvorming gezamenlijk optreden om het normale skelet in gezondheid en ziekte handhaven omvat.
Als belangrijkste botresorberende cellen in het lichaam, kunnen veranderingen in osteoclastdifferentiatie of functie leiden tot ingrijpende effecten in het lichaam. Ziekten geassocieerd met veranderde functie van osteoclasten kan in ernst variëren van dodelijke neonatale ziekte gevolg van het niet een merg ruimte hematopoiese vormen om vaker waargenomen aandoeningen zoals osteoporose, waarbij overmatige osteoclastische botresorptie predisponeert vorming breken.
ent "> Het vermogen om osteoclasten te isoleren in hoge aantallen in vitro is toegestaan aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van de botombouw cyclus en is de weg voor de ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën die deze ziekten te bestrijden verhard.Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken osteoclasten uit muizen beenmerg dat grote aantallen osteoclasten oplevert.
Introduction
Botremodellering is dynamisch en het gaat om de koppeling van botvorming met botresorptie 1. Dit strak gereguleerd proces is verantwoordelijk voor het skelet tijdens normale homeostase, en in reactie op letsel en ziekte.
Osteoclasten zijn uniek, meerkernige cellen die in staat zijn resorbeerbare zowel de organische als anorganische matrices van bot. Osteoclasten zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg 2-5. Afwijkingen in de functie of vorming van osteoclasten kan resulteren in verschillende klinische aandoeningen, waaronder gemeenschappelijke aandoeningen zoals osteoporose.
Het vermogen om osteoclasten in vitro genereren is toegestaan aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van botbiologie 6. Daardoor worden nieuwe opkomende therapeutische middelen aan osteoclasten ziekten die verantwoordelijk zijn voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit behandelen 7 </sup>. Homeostatische onderhoud van de botmassa en kracht vereist de gezamenlijke actie van botvormende osteoblasten en-botresorberende osteoclasten 8,9. Bothomeostase gewijzigd wordt een aantal ziekten, waaronder postmenopauzale osteoporose, waarbij verhoogde osteoclastische activiteit leidt tot pathogene verlies van botmassa en dichtheid 10. Met toenemende beschikbaarheid van transgene muismodellen voor humane ziekten, is er meer gelegenheid om de rol van de osteoclasten ontcijferen menselijke botziekte 11-13.
Talrijke protocollen voor osteoclasten kweektechnieken verschijnen in de literatuur vele variaties beschreven 9,12,14. Xing en collega's beschrijven soortgelijke methodologie de hieronder beschreven in de beschrijving van osteoclastogenic assays van murine beenmergcellen protocol. Echter de beenmergcellen na lang bot oogst vrij, Xing et al. Spoel de mergholte met α-MEM compleet medium14. Catalfamo onderzoekt het effect van hyperglycemie op de functie van osteoclasten en beschrijft een werkwijze waarbij alle cellen gemobiliseerd beenmerg spoelen worden gedurende 24 uur, waarna de niet-hechtende cellen verwijderd 12, een techniek die ook door Boyle et al . 9 De eerder gepubliceerde protocollen vereisen het gebruik van spoelen van het beenmerg, een vervelende praktijk, die ook introduceert het risico van een naald prikt en verlies van waardevolle beenmerg, als een beide uiteinden van het bot moet snijden. Het protocol, dat we beschrijven implementeert het gebruik van een mortier en stamper om osteoclasten te isoleren, die vergelijkbaar is met de werkwijze beschreven door macrofaag isolatie Weischenfeldt et al. 15
Onze ervaring is echter dat osteoclast isolatie en in vitro kweek met eerder gepubliceerde technieken leidt tot variabele resultaten inzake osteoclast productie, vaak resulterendin een onvermogen te cultiveren osteoclasten. Daarom hebben we een protocol waarmee de consequente scheiding van muis beenmerg grote aantallen meerkernige osteoclasten in vitro produceren met een geschatte opbrengst van 70-80% van de cellen aanvankelijk vormen macrofagen uitgeplaat en vervolgens osteoclasten ontwikkeld in aanwezigheid van osteoclasten inductie media.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een mogelijkheid om eenvoudig te isoleren en te kweken grote aantallen osteoclasten in vitro is verantwoordelijk voor het helpen om het begrip van botbiologie en osteoclasten gemedieerde ziekten vooruit geweest. Het was de identificatie van RANKL die leiden tot deze, wanneer het onlangs geïdentificeerd als de belangrijkste regulator van osteoclastvorming, differentiatie en overleving 16-18.
Het is onze ervaring dat het in vitro kweken van osteoclasten uit beenme…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de steun van NIH subsidies R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation en The Hagey Laboratorium voor Pediatrische Regenerative Medicine.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
