Остеокластов Вывод из костного мозга мыши
Summary
Остеокласты основной клеток костного резорбции в организме. Возможность изолировать остеокластов в больших количествах привело к значительному прогрессу в понимании остеокластов биологии. В этом протоколе, мы опишем метод для изоляции, культивирования и количественного активность остеокластов в пробирке.
Abstract
Остеокласты высоко специализированные клетки, которые являются производными от моноцитов / макрофагов костного мозга. Их уникальная способность поглощать как органические, так и неорганические матрицы кости означает, что они играют ключевую роль в регуляции скелетных ремоделирования. Вместе остеобласты и остеокласты отвечают за динамического процесса связи в который вовлечены и резорбции кости и образование костной ткани, действующее вместе для поддержания нормального скелета во время здоровья и болезни.
В качестве основного клетки костной резорбции в организме, изменение остеокластов дифференциации или функции может привести к глубоким эффектов в организме. Заболевания, связанные с измененной функции остеокластов может изменяться в тяжести от смертельной заболевания у новорожденных из-за отказа сформировать пространство мозга для кроветворения, чтобы чаще наблюдается патологий, таких как остеопороз, в котором чрезмерное остеокластов резорбции кости предрасполагает к разрушению образования.
ЛОР "> Возможность изолировать остеокластов в больших количествах в лабораторных позволило добиться значительных успехов в понимании цикла костного ремоделирования и проложил путь для открытия новых терапевтических стратегий, борьбе с этими заболеваниями.Здесь мы опишем протокол для изоляции и культивировать остеокластов из костного мозга мыши, который будет давать большое число остеокластов.
Introduction
Костного ремоделирования является динамичным и включает муфту формирования костей с костной резорбции 1. Это жестко регулируется процесс отвечает за поддержание скелет в нормальном гомеостаза, и в ответ на повреждение и болезни.
Остеокласты уникальны, многоядерные клетки, которые способны к резорбции как органические, так и неорганические матрицы кости. Остеокласты выводятся из моноцитов / макрофагов костного мозга 2-5. Отклонения в функции или образованием остеокластов может привести в различных клинических патологий, в том числе общих заболеваний, как остеопороз.
Способность генерировать остеокластов в пробирке позволило значительному прогрессу в нашем понимании кости биологии 6. В результате, новые терапевтические агенты для лечения возникающих остеокластов, связанные с заболеваниями, которые ответственны за значительных заболеваний и смертности 7 </sдо>. Гомеостатическое поддержание костной массы и силы требует согласованных действий формирования костной остеобластов и костей резорбции остеокластов 8,9. Гомеостаза кости изменяется в ряде заболеваний, в том числе постклимактерического остеопороза, в которой увеличена активность остеокластов приводит к патогенным потери костной массы и плотности 10. С увеличением доступности трансгенных мышиных моделях заболеваний человека, есть еще возможность расшифровать роль остеокластов в человеческой болезни костей 11-13.
Многочисленные протоколы методов остеокластов культивирования появляются в литературе, с много вариантов описано 9,12,14. Син и его коллеги описывают аналогичную методику с протоколом, описанным ниже, в их описании osteoclastogenic анализов из мышиных клеток костного мозга. Тем не менее, чтобы освободить клетки костного мозга следующие урожая длинных костей, Син и др. Промывать полость костного мозга с α-MEM полной среде14. Catalfamo исследован эффект гипергликемии на функцию остеокластов и описывает способ, в котором все клетки мобилизовали путем промывки костного мозга культивировали в течение 24 ч, после чего неадгезивные клетки отбрасывали 12, техника также используется Бойл и др . 9 Эти ранее опубликованные протоколы требуют практику промывки костный мозг, утомительной практики, которая также вводит риск травмы иглой и потере ценного костного мозга, как надо отрезать оба конца кости. Протокол, который мы описываем, реализует использование в ступке с пестиком, чтобы изолировать остеокласты, который подобен способу, описанному макрофагов изоляции по Weischenfeldt и др. 15
Наш опыт, однако, является то, что изоляция остеокластов и в культуре пробирке, используя ранее опубликованные методы результаты в переменных результатов с точки зрения производства остеокластов, что часто приводитв неспособности развивать остеокластов. Таким образом, мы разработали протокол, который позволяет для последовательного выделения из костного мозга мыши, чтобы получить большое количество многоядерных остеокластов в пробирке, с приблизительной выходом 70-80% клеток, первоначально плакированных формирования макрофаги и впоследствии остеокласты, в присутствии индукционные остеокластов СМИ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность легко изолировать и вырастить большое количество остеокластов в пробирке был ответственен за помощь для углубления понимания биологии кости и остеокластов-опосредованных заболеваний. Это было определение RANKL, что приведет к этому, когда он был недавно идентифициров?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем поддержку грантов НИЗ R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Фонда Дуб и Hagey лаборатории детской регенеративной медицины.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
