Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea
Summary
Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.
Abstract
Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença.
À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada.
ent "> A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças.Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.
Introduction
A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea 1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças.
Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea 2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose.
A capacidade de gerar osteoclastos in vitro tem permitido avanços significativos em nossa compreensão da biologia óssea 6. Como resultado, os novos agentes terapêuticos estão a emergir para tratar doenças relacionadas com osteoclastos que são responsáveis pela morbilidades e mortalidades significativas 7 </sacima>. Manutenção homeostática da massa óssea e força exige a acção concertada dos osteoblastos da formação óssea e osteoclastos de reabsorção óssea 8,9. Homeostase óssea é modificado de uma série de doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa, em que o aumento da actividade de osteoclastos levando à perda de massa óssea patogénico e densidade de 10. Com o aumento da disponibilidade de modelos murinos transgénicos de doença humana, há mais oportunidade para decifrar o papel dos osteoclastos na doença óssea humana 11-13.
Inúmeros protocolos para técnicas de cultura de osteoclastos aparecem na literatura, com muitas variações descritas 9,12,14. Xing e colegas descrevem uma metodologia semelhante para o protocolo descrito abaixo, na descrição de ensaios osteoclastogênicos a partir de células de medula óssea de murino. No entanto, para libertar as células de medula óssea seguintes colheita de osso longo, Xing et al. Lave a cavidade da medula com α-MEM meio completo14. Catalfamo examina o efeito da hiperglicemia em função dos osteoclastos e descreve um método em que todas as células mobilizadas pela lavagem da medula óssea são cultivadas durante 24 horas, altura em que as células não-aderentes são descartados 12, uma técnica também usada por Boyle et ai . 9 Estes protocolos previamente publicados exigem a prática de lavagem da medula óssea, uma prática tedioso, que também introduz o risco de um ferimento por picada de agulha e perda de medula óssea valiosa, pois é necessário cortar ambas as extremidades do osso. O protocolo, que descrevemos, implementa a utilização de um almofariz e pilão para isolar os osteoclastos, que é semelhante ao processo de isolamento descrito por macrófagos Weischenfeldt et al 15.
A nossa experiência, contudo, é que o isolamento dos osteoclastos e da cultura in vitro usando técnicas de resultados anteriormente publicados nos resultados variáveis em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultandona impossibilidade de cultivar osteoclastos. Por conseguinte, temos desenvolvido um protocolo que permite o isolamento consistente de medula óssea de ratinho para produzir um grande número de osteoclastos in vitro, multinucleadas, com um rendimento aproximado de 70-80% das células plaqueadas inicialmente formando macrófagos e, subsequentemente, osteoclastos, na presença de meio de indução de osteoclastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência de 16-18.
Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio do NIH concede R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, a Fundação Oak eo Laboratório Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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