Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris
Summary
Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.
Abstract
Les ostéoclastes sont des cellules hautement spécialisées qui sont dérivés de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse. Leur capacité unique à se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os signifie qu'ils jouent un rôle clé dans la régulation de remodelage osseux. Ensemble, les ostéoblastes et les ostéoclastes sont responsables du processus de couplage dynamique qui implique à la fois la résorption osseuse et la formation osseuse agissant de concert pour maintenir le squelette normal pendant la santé et la maladie.
Comme la cellule principale de résorption osseuse dans le corps, des changements dans la différentiation ou la fonction des ostéoclastes peuvent entraîner des effets profonds dans le corps. Les maladies associées à la fonction des ostéoclastes modifié peut varier dans la sévérité de la maladie néonatale létale due à l'échec à former un espace de moelle pour l'hématopoïèse, à des pathologies telles que l'ostéoporose, dans lequel excessive résorption osseuse ostéoclastique prédispose aux fractures formation plus couramment observé.
ent "> Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension du cycle de remodelage osseux et a ouvert la voie à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques qui luttent contre ces maladies.Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les ostéoclastes de moelle osseuse de souris qui donnera un grand nombre d'ostéoclastes.
Introduction
Le remodelage osseux est dynamique et implique le couplage de la formation osseuse à la résorption osseuse 1. Ce processus finement régulé est responsable du maintien du squelette au cours de l'homéostasie normale, et en réponse à une blessure et maladie.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées uniques qui sont capables de se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os. Les ostéoclastes sont issus de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse 5.2. Les anomalies de la fonction ou de la formation des ostéoclastes peuvent entraîner une variété de pathologies cliniques, y compris les conditions courantes telles que l'ostéoporose.
La capacité de générer des ostéoclastes in vitro a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie de l'os 6. En conséquence, de nouveaux agents thérapeutiques émergent pour traiter des maladies liées aux ostéoclastes qui sont responsables de la morbidité et de la mortalité importantes 7 </sjusqu'à>. Entretien homéostatique de la masse osseuse et la force nécessite l'action concertée des ostéoblastes de la formation osseuse et les ostéoclastes de résorption osseuse 8,9. homéostasie osseuse est modifiée dans un certain nombre de maladies, y compris l'ostéoporose post-ménopausique, dans lequel une activité accrue des ostéoclastes conduit à la perte pathogène de la masse osseuse et de la densité 10. Avec l'augmentation de la disponibilité des modèles murins transgéniques de la maladie humaine, il n'y a plus possibilité de déchiffrer le rôle des ostéoclastes dans la maladie de l'os humain 11-13.
De nombreux protocoles pour des techniques de culture d'ostéoclastes apparaissent dans la littérature, avec de nombreuses variantes décrites 9,12,14. Xing et ses collègues décrivent une méthodologie similaire au protocole décrit ci-dessous, dans leur description de dosages ostéoclastogéniques à partir de cellules de la moelle osseuse de souris. Cependant, pour libérer les cellules de la moelle osseuse après la récolte des os longs, Xing et al. Vider la cavité médullaire d'α-MEM milieu complet14. Catalfamo examine l'effet de l'hyperglycémie sur la fonction des ostéoclastes et décrit un procédé dans lequel toutes les cellules mobilisées rinçage de la moelle osseuse par des sont cultivées pendant 24 heures, après quoi les cellules non adhérentes sont éliminées 12, une technique également utilisée par Boyle et al . 9 Ces protocoles publiés précédemment nécessitent la pratique de la chasse d'eau de la moelle osseuse, une pratique fastidieux, qui présente aussi le risque d'une blessure par piqûre d'aiguille et de la perte de valeur de la moelle osseuse, comme on doit couper les deux extrémités de l'os. Le protocole, que nous décrivons, met en oeuvre l'utilisation d'un mortier et d'un pilon pour isoler les ostéoclastes, qui est similaire à la méthode d'isolement de macrophages décrit par Weischenfeldt 15 et al.
Notre expérience, cependant, est que l'isolement des ostéoclastes et la culture in vitro en utilisant les résultats des techniques déjà publiés dans les résultats variables en termes de production des ostéoclastes, ce qui entraîne souventune incapacité à cultiver les ostéoclastes. Par conséquent, nous avons mis au point un protocole qui permet l'isolement compatible de moelle osseuse de souris pour produire un grand nombre d'ostéoclastes multinucléés in vitro, avec un rendement approximatif de 70 à 80% des cellules plaquées initialement la formation d'ostéoclastes et des macrophages par la suite, en présence de médias ostéoclastes à induction.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une capacité d'isoler et de cultiver facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro a été chargé d'aider à faire progresser la compréhension de la biologie des maladies des os et des ostéoclastes. Il a été l'identification de RANKL qui mènent à cela, quand il a récemment été identifié comme le principal régulateur de la formation des ostéoclastes, la différenciation et la survie 16-18.
Il a été notre expérience que la culture …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l'appui de subventions des NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, la Fondation Oak et le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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