Abstract
Under utveckling, hematopoietiska celler härrör från en specialiserad delmängd av endotelceller, hemogenic endotel (HE). Modellering HE utveckling in vitro är avgörande för mekanistiska studier av endotel-hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Här beskriver vi en metod för effektiv induktion av HE från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) genom överuttryck av olika uppsättningar av transkriptionsfaktorer. Kombinationen av ETV2 och GATA1 eller GATA2 TF: används för att inducera HE med pan-myeloid potential, medan en kombination av GATA2 och TAL1 transkriptionsfaktorer medger framställning av HE med erytroida och megakaryocytisk potential. Tillsatsen av LMO2 till GATA2 och TAL1 kombination väsentligen accelererar differentiering och ökar erytroida och megakaryocytiska celler produktion. Denna metod ger ett effektivt och snabbt sätt att HE induktion från hPSCs och möjliggör observation av endotel-hematopoietic övergång i en odlingsskål. Protokollet inkluderar procedurer hPSCs överföring och efter transduktion analys av HE och blod stamceller.
Introduction
Den unika förmågan hos humana pluripotenta stamceller (hPSCs) att själv förnya och att differentiera till celler av de tre groddblad, inklusive blod, gör dem till ett värdefullt verktyg för mekanistiska studier av hematopoetiskt utveckling, modellering av blodsjukdomar, läkemedelsscreening, toxicitetsstudier, samt utveckling av cellulära terapier. Eftersom blodbildningen i embryot intäkterna från hemogenic endotel (HE) genom en endothelial hematopoetisk övergång 1,2, skulle generering av HE i kulturer vara avgörande för att studera de molekylära mekanismer som reglerar endotel till hematopoetisk övergång och hematopoetisk specifikation. Aktuella metoder för studier av HE är baserade på induktion av hematoendothelial differentiering i aggregat (EBS) med tillägg av hematopoietiska cytokiner 3-5, och samodling av hPSCs med Blodbildning-stödjande stromaceller 6,7 eller i två-dimensionella odlingar med extracellulärt matriser och cytokines 8,9. Dessa klassiska differentiering metoder är baserade på införandet av externa signaler som verkar på cellytan och initiera kaskader av molekylära vägar som så småningom leder till aktivering av transkriptions program vägledande hematoendothelial utveckling. Sålunda effektivitet hPSCs indelningar i dessa system förlitar sig på en effektiv induktion av dessa signaler, signaltransduktion till kärnan, och den resulterande aktivering av specifika transkriptionsregulatorer. Dessutom har studier av HE i konventionella differentieringsodlingar kräver det ytterligare steget att isolera HE celler med användning av cellsortering. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för direkt induktion av HE och blod genom överexpression av hematopoietiska transkriptionsfaktorer. Denna metod möjliggör effektiv induktion av HE i en skål och direkt observation av den endoteliala hematopoietiska övergång utan behov av isolering av HE med användning av en besvärlig cellsorteringsproceduren.
Bildning av HE och blod från humana pluripotenta stamceller kan effektivt induceras genom överuttryck bara några transkriptionsfaktorer (TFS). Den optimala kombinationen av TF kan inducera robusta pan-myeloid hematopoies från hPSCs inkluderar ETV2 och GATA1 eller GATA2. I motsats, en kombination av GATA2 och TAL1 inducerar erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmering hPSCs genom överuttryck av dessa faktorer skiljer hPSCs direkt till VE-cad + CD43 - CD73 - HE celler som gradvis förvärva hematopoetisk fenotyp definieras genom uttrycket av tidiga hematopoetiska markör CD43 7. Detta lentiviral-baserad metod för direkt programmering av mänskliga pluripotenta stamceller metod är tillämplig för generering av HE och blodceller för mekanistiska studier, studier av endotel hematopoietiska omvandlingar och transkriptionsreglering av hematopoetisk utveckling och specifikation. Även om cktuellt protokoll beskriver produktion blod med användning av konstitutiv expression av transgenerna, liknande resultat kan erhållas med användning av modifierat mRNA 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Virus Framställningar och transkriptionsfaktor Kombinationer
- Bered lösningar med PSIN-EF1a Lentiviral expressionsplasmid innehållande proteinkodande DNA för ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 och LMO2 (tabell 1).
- Mäta koncentrationen och renheten hos plasmid preparaten som används för Lentiviral produktion genom att registrera UV-absorption med en spektrofotometer vid 230 nm, 260 nm och 280 nm. Obs: DNA-preparat visar A260 / 280 och A260 / 230 värden större än 1,8 är allmänt anses vara god kvalitet. Lägre A260 / 280 värden kan tyda på förorening protein, medan lägre A260 / 230 värden indikerar föroreningar med salter eller något lösningsmedel, såsom fenol. Rekommenderad plasmid koncentration är 1-3 mikrogram / l.
- Producera lentivirus för transduktioner som beskrivs i tidigare publicerade protokoll 11. Induktion av HE med pan-myeloid potential krävs samexpression av ETV2 och GATA1 eller ETV2 och GATA2.Induktion av HE med erytro- och megakaryocytisk potential krävs GATA2 och TAL1. Tillsatsen av LMO2 signifikant förbättrar utbytet av erytro-megakaryocytiska celler från hPSCs i närvaro av GATA2 och TAL1 10.
2. hPSCs kultur protokollet
- Väx pluripotenta stamceller i trånga kolonier med skarpa kanter till 70-80% konfluens innan subodling. Mark och ta bort spontant differentierade kolonier innan passage celler.
- Späd kommersiell extracellulära matrisgel (se tabell 2) enligt tillverkarens instruktioner och päls 6 brunnar över natten vid 4 ° C, eller åtminstone en timme vid 37 ° C före användning. Innan passage celler, aspirera matrisen, tillsätt 2 ml av färsk kommersiell komplett culturemedium (se tabell 2) och hålla plattorna vid 37 ° C, 5% CO2 tills cellerna är redo för sådd.
- Passage hPSCs
- Aspirate medium från en konfluent brunn i en 6-brunnsplatta med hPSCs och tillsätt 1,5 ml förvärmda Dispase II-lösning (2 mg / ml i DMEM / F12, steriliseras genom filtrering genom 0,22 ^ m filter). Inkubera under 5-7 minuter vid 37 ° C, 5% CO2 tills kanterna på kolonierna börjar lyfta från ytan.
- Sug Dispase II-lösning och noggrant tvätta kolonierna två gånger genom att lägga till och sedan aspire 2 ml färskt DMEM / F12-medium. Sedan, med hjälp av en 5 ml serologisk glaspipett, dissociera hPSCs med 3 ml färsk kommersiell komplett odlingsmedium (se tabell 2) genom att pipettera cellsuspensionen upp och ned flera gånger.
- Tillsätt 0,5 ml av cellsuspension till varje brunn i en 6-brunnars platta innehållande 1,5 ml kommersiell komplett odlingsmedium (se tabell 2). Skaka plattan fram och tillbaka och höger till vänster flera gånger för att säkerställa en likformig cellfördelning när placera plattan i inkubatorn. Håll cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under en8-24 h.
- Nästa dag förändringen medium till färskt kommersiell komplett odlingsmedium (se tabell 2) och undersöka hPSCs morfologi. Framgångsrika passage resulterar i små, väl lösa kolonier behålla hPSC morfologi. hPSCs måste matas med 2,5-3 ml freshmedium per brunn på en daglig basis och passe var 4-5 dagar till högst 70-80% sammanflödet.
OBS: Om hiPSCs hölls på mus embryonala fibroblaster (MEF), måste de överföras till matarfria förhållanden och passerades 2-3 gånger innan transduktion att säkerställa en effektiv differentiering.
3. Induktion av Hematoendothelial Pprecursors från hPSCs (dag 0, Transduction av hPSCs)
- För att framställa reaktionsmedium kombinera 1,3 ml kommersiell komplett serumfritt medium (se tabell 2), virus, polybren, och Y27632 ROCK-inhibitor (tabell 1): tillsätt 1,3 | il av 10 mM ROCK hämmare till 1,3 ml medium till en slutlig koncenning av 10 ^ M, och polybren till en slutlig koncentration 6 pg / ml.
- Lägg en lämplig mängd viralt koncentrat (s) med en slutkoncentration av 0,5-1,0 MOI (infektionsmultiplicitet) av varje virus per cell. Håll reaktionsmediet på is eller vid 4 ° C tills enkelcellsuspension är redo.
OBS: Samma mängd MOI för varje virus i GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, och GATA2 / TAL1 / LMO2 reaktionsblandningar är optimal för induktion av differentiering. Men i ETV2 / GATA2 omvandlade kulturer fördubbling MOI för GATA2, i förhållande till ETV2, förbättrar differentiering. Därför, för dessa kulturer, förhållandet 1: 2 för MOI av ETV2 och en MOI av GATA2 rekommenderas (t.ex. om viruskoncentrat beräknas cirka 6,8 x 10 7 partiklar / ml, tillsätt 10 pl av ETV2 och 20 pl GATA2 virala koncentrat till 0,68 x 10 6 celler per en ETV2 / GATA2 reaktion i en 35 mm brunn i en 6-brunnar).
- Lägg en lämplig mängd viralt koncentrat (s) med en slutkoncentration av 0,5-1,0 MOI (infektionsmultiplicitet) av varje virus per cell. Håll reaktionsmediet på is eller vid 4 ° C tills enkelcellsuspension är redo.
- Förbered hPSCs i en enda cell suspension.
- Odla hPSCs i matarfria förhållanden som beskrivs i avsnitt 2. På dag 4 efter den sista passagen, observera celltätheten och morfologi under ett inverterat mikroskop. hPSCs bör växa i trånga kolonier med skarpa kanter utan någon spontan differentiering och nå ~ 60-70% konfluens på dagen för transduktion.
- Aspirera medium till 1,5-2 ml kommersiell cell dissociation reagens (tabell 1) per brunn och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 5-7 minuter.
- Samla cellerna i lika stora volymer av kommersiell fullständigt medium (se tabell 2) med 10 pM av ROCK-inhibitor, räkna cellerna och bestämma viabilitet. Pelletera celler genom centrifugering vid 200 xg under 5 min och sedan återsuspendera celler i kommersiell fullständigt medium med 10 | iM av ROCK-inhibitor till en koncentration av 3.4-5 x 10 6 celler per ml.
OBS: Cellviabiliteten är avgörande för framgångsrik viral transduktion och efterföljande differentiering.Normalt bör cellviabiliteten före transduktion överstiga 90%.
- Tillsätt 200 ul av cellsuspensionen, innehållande 0.68-1 x10 6 celler, in i 1,3 ml av reaktionsmediet som framställts i 3,1.
- Aspirera matrislösning från natten belagda 6-brunnar framställd i 2.2., Överföra reaktionsblandningen till en brunn i en 6-brunnar och fördela celler jämnt. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 24 timmar. Efter 24 timmar vid minst 80% av cellerna ska fästas till matrisen.
4. Induktion av Hematoendothelial prekursorer från hPSCs (Dag 1-7)
- 24 h efter transduktion, avlägsna virusinnehållande mediet och tvätta vidhäftade celler med kommersiell ofullständig cellodlingsmedium (se tabell 1) och tillsätt sedan 3 ml per brunn av kommersiell ofullständig cellkulturmedium innehållande hematopoietiska cytokiner: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (nedan kallade 3F-medium).
- Ersätta det medium med färskt 3F-mediet på dag 2, 3 och dag 4 för att ta bort döda celler och skräp. Efter dag 4, när flytande hematopoietiska celler växer fram, byt hälften av 3F-mediet varannan dag, medan den totala volymen hölls vid 4 ml.
OBS: PSIN-EF1a Lentiviral uttryckningsplasmider införliva puromycinresistensgenen vilket möjliggör positiv selektion av omvandlade celler. Den 1 fig / ml puromycin kan sättas till mediet under de första 1-2 dagarna av differentiering för att eliminera eventuella kvarvarande odifferentierade hPSCs. - Beakta cellmorfologin dag 4 under ett inverterat mikroskop: snäva kluster av celler med typisk endotel morfologi börja visas (figur 2A, 3A). Runda blodkroppar framgår av dag 5 till dag 7 av differentiering, medan vissa områden får behålla hPSCs morfologi. Analysera HE och hematopoetisk differentiering som beskrivs nedan.
OBS: Lyckad hematoendothelial annorlundaiation resulterar i produktion av blodkroppar som visas som refraktila runda celler löst fäst vid underliggande plana endotelceller. Dessa celler förökar sig aktivt bildar små aggregat, och så småningom loss och flyta (figurerna 2A och 3A). Levande blodkroppar kan vara visuellt skiljer sig från de döda och döende celler baserat på deras förmåga att reflektera ljuset och expandera i odlingsbetingelser.
5. Analys av Hemogenic endotelet (HE) Stadium Differentiation.
- Upptäcka bildandet av HE mellan dagarna 3 och 4 av differentiering genom mikroskopisk observation av celler med endotel morfologi. Det finns inga flytande blodkroppar i kultur i detta skede av differentiering. Närvaron av HE kan bekräftas genom immunofluorescerande färgning och flödescytometrisk analys med hjälp av VE-cadherin, CD73, CD226 och CD43-antikroppar.
- För att bedöma HE bildning genom flödescytometrisk analys använder celler på dag 3och dag 4 från ett experiment. Samla cellerna genom inkubering av kulturer med kommersiell cell dissociation reagens (se tabell 1) under 5-10 min vid 37 ° C, 5% CO2 och sedan använda upp till 1 x 10 5 celler per färgningsreaktion (flödescytometri färgnings förfarandet beskrivet i 12).
OBS: VE-cadherin + HE celler förvärvar uttryck för tidig hematopoetisk markör CD226, men saknar ett uttryck för CD73 och CD43 6. I motsats därtill icke-HE-celler uttrycker CD73 (fig 2B, 3B).
- För att bedöma HE bildning genom flödescytometrisk analys använder celler på dag 3och dag 4 från ett experiment. Samla cellerna genom inkubering av kulturer med kommersiell cell dissociation reagens (se tabell 1) under 5-10 min vid 37 ° C, 5% CO2 och sedan använda upp till 1 x 10 5 celler per färgningsreaktion (flödescytometri färgnings förfarandet beskrivet i 12).
- Immunofluorescens färgning för hPSC härrörande HE.
- Tvätta det bifogade monoskiktet av celler med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och därefter fastställa celler i 4% paraformaldehyd från 30 till 60 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna en gång med PBS och sedan permeabilisera användning 0,1% Triton X-100 i PBS under 20 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna i PBS två till tre gånger och sedan inkubera iblockeringsbuffert bestående av PBS med 10% fetalt bovint serum (FBS), för 30 till 120 minuter.
- Bered färgningslösningen, innehållande både primära antikroppar (1: 1000 spädning) mus-anti-human-CD43 och kanin-anti-humana VE-cadherin i PBS med 5% FBS, (tabell 1).
- Aspirera blockeringsbufferten från cellerna och tillsätt 1 ml per brunn av färgningsbuffert med de tillsatta primära antikroppar; inkubera 3 h vid rumstemperatur, eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger genom tillsats av 2 ml PBS med 5% FBS.
- Förbered en andra färgning buffert, som innehåller sekundära antikroppar vid en: 500 utspädning i PBS med 5% FBS: åsne-anti-kanin konjugerad med grönt fluorescerande färgämne, och anti-mus konjugerad med röd fluorescerande färg (tabell 1). Tillsätt 1 ml per brunn av sekundär färgning buffert och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme.
- Tvätta tre gånger med PBS utan serum. Stain celler med 300 nM DAPI arbetslösning i dH2 O under 10-15 min.
- Tvätta cellerna med PBS två gånger och tillsätt 2-3 ml PBS i väl med färgade celler. Observera fluorescens med gröna, röda och blå mikroskop filter.
6. Analys av inducerad Hematopoietic prekursorer
- Behåll differentieringsodlingar tills flytande celler expanderar kraftigt, upp till 10-14 dagar, ändra hälften av 3F-mediet, som beskrivs i 3.1, varannan dag.
- Dissociera och samla differentiera monoskikt av celler genom att behandla celler med en kommersiell cell dissociation reagens (se tabell 1) under 5 till 10 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
- Utför flödescytometri med användning av anti-VE-cadherin, CD43 och CD45-antikroppar för att utvärdera hematopoies i kulturer 12. Observera att en stor fraktion av celler, upp till 40% av ETV2 och GATA2 transducerade celler, co-uttrycker VE-cad och CD43. Följande antikroppar kan användas för att detektera specifika cellhärstamningar följande eXpansion eller differentieringen av inducerade blod stamceller: CD235a (erytroidceller), CD41a (megakaryocytiska), CD32 (alla typer av myeloidceller), CD66b (neutrofiler) och CD163 (makrofager).
- Utför CFC-analys med användning av ett kommersiellt klonogen medium (tabell 1) enligt tillverkarens anvisningar.
- Överför 1-2 x 10 4 celler i 3 ml kommersiell klonogeniska medium (se tabell 3) att bedöma antalet kolonibildande celler och typer av hematopoetiska kolonier. Optimal såddtäthet möjliggör identifiering och isolering av enstaka kolonier som växer separat från varandra och inte överlappar varandra. Såddtäthet kan variera mellan experiment beroende på differentiering effektivitet, men bör inte överstiga 1 x 10 4 celler per 1 ml kommersiell klonogena medium.
- Blanda cellerna i kommersiella klonogena medium genom varsam vortexa och överföra 3 ml suspension till två 35 mm ultralåga fäst rätterför CFC-analysen, 1,5 ml suspension till varje skål. Fördela mediet jämnt och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 14 dagar. Undvika att störa rätter; observera kolonibildning på dag 7 och dag 10 av analys.
- Identifiera och räkna hematopoietiska kolonier enligt deras morfologi på dag 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schemat i HE och blod induktion från hPSCs genom överuttryck av transkriptionsfaktorer visas i Figur 1. ETV2 med GATA1 eller GATA2 kombination inducerar pan-myeloid hematopoies, medan en GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombination inducerar övervägande erytro-megakaryocytisk hematopoies. Båda TF kombinationer direkt inducerade HE celler som sedan omvandlas till blod stamceller med en distinkt spektrum av hematopoetisk differentiering. Differentieringen av hPSCs från pluripotent tillstånd till blod producerar han tar i genomsnitt 4 dagar. Runda blodkroppar uppstår först vid dag 5 av differentiering. Därefter många flytande blodkroppar visas och expandera i kulturer. För att maximera antalet flytande blodkroppar, kan efter transduktion kulturer förlängas till 10-14 dagar. Den önskade linjen av celler kan expanderas i låg-vidhäftande förhållanden med en lämplig kombination av hematopoetiska cytokiner. Figur 2 DEMonstrates induktionen av blod från hPSCs använder ETV2 och GATA1 eller GATA2 TF: er. Efter transduktion med ETV2 och GATA2 celler förvärva en typisk endotel morfologi dag 4 av differentiering, och så småningom förvandlas till runda blodkroppar (dag 6-8 av differentiering (Figur 2A). Celler som samlats på dagarna 3-4 av differentiering visar en typisk VE-cadherin + CD226 + CD73 -. HE fenotyp (Figur 2B, 3B) Dag 7 av differentiering mer än 50% av VE-cadherin + celler förvärva hematopoetisk CD43 + fenotyp (Figur 2C) CFC-analyser av GATA2 / ETV2. inducerade celler visar att kolonier består av hög proliferativ potential (HPP) CFC, erytroid (E) CFC, makrofager (M) CFC, och granulocyter (G) CFC (Figur 2E). Den hematoendothelial differentiering i hPSCs efter överuttryck av GATA2 och TAL1 ensamt eller medLMO2 visas i figur 3. HE skede bäst identifieras i kulturer med GATA2 och TAL1. Tillsatsen av LMO2 accelererar differentiering och markant kontrakt HE skede. Den GATA2 och TAL1 kombination enbart eller med LMO2 visar differentiering och mognad av blodursprungsceller till mestadels erytroida och megakaryocytiska celler fig 3D och 3E. Figur 4 visar optimering av transduktionseffektiviteten i H1 hESCs användning GFP lentivirus (A) och celldöd och differentiering effektivitet i kulturer omvandlade med GATA2 / TAL1 / LMO2 vid hög och låg MOI.
Figur 1:. Skiss av protokoll för induktion av hemogenic endotel och blodceller via tvångs uttrycket av TF Cartoon beskriver viktiga experimentella steg och tidslinjer. Efter framställning av enkelcellsuspension är hPSCs transduceras med TFs och såddes på matris i fullständig kommersiella serumfritt medium. Nästa dag, ersattes mediet med tillväxtfaktor fri kommersiell medium kompletterat med bFGF, TPO och SCF (3F Medium). Efter 3-4 dagars odling, är han bildade. Därefter genomgår HE endotel till hematopoetisk övergång med bildandet av flera blodkroppar.
Figur 2:. ETV2 / GATA2-inducerad differentiering av hPSCs (A) fas kontrastrika bilder av ETV2 / GATA2-inducerad differentiering i H1 hESCs på dag 2, 4, 6 och 8 efter transduktion; Skal, 100 | j, m. (B) Flödescytometrisk analys av ETV2 / GATA2-inducerade celler som genomgår endotel hematopoietiska övergång vid dag 3 av differentiering: VE-cadherin + HE celler uttrycker CD226 och saknar uttryck av CD73. En liten andel av endoteliala celler uttrycker CD73 (icke-HE). (C) Flödescytometrisk enNALYS AV ETV2 / GATA1- och ETV2 / GATA2-inducerad H1 hPSCs på dag 7 efter transduktion. (D) Flödescytometrisk analys av ETV2 / GATA2-inducerade hematopoietiska celler expanderade i medium kompletterat med FBS och SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF och EPO i 14 dagar. (E) Typer av hematopoietiska kolonier som bildats från ETV2 / GATA2 transducerade celler i CFC-analysen och motsvarande Wright-färgade cytospins representerar erytroid (E), makrofager (M), granulocyter (Gr) och High Proliferativa Potentiella kolonier (HPPs). Skala barer för CFC-analys, 250 pm, för cytospins, 20 pm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. GATA2 / TAL1 och GATA2 / TAL1 / LMO2-inducerad differentiering av hPSCs (A) fas kontrastrika bilder av GATA2 / TAL1 / LMO2inducerad differentiering i H1 hESCs på dag 2, 4, 6 och 8; Skal, 100 | j, m. (B) Flödescytometrisk analys av GATA2 / TAL1-inducerade celler som genomgår endotel till hematopoetisk övergång dag 3 av differentiering: VE-cadherin + celler förvärvar uttryck av HE markör CD226. En liten andel av endoteliala celler uttrycker CD73 (icke-HE). (C) immunofluorescerande färgning av GATA2 / TAL1-inducerad differentiering i H1 hESC, dag 5; VE-cadherin + celler (grön) förvärvar uttryck för hematopoetisk markör CD43 (röd). (D) Flödescytometrisk analys av GATA2 / TAL1 / LMO2-inducerad hematopoietiska kulturer i suspension på dag 14 efter transduktion efter expansion i serumfritt medium kompletterat med SCF, TPO, EPO och bFGF; (E) Typer av hematopoietiska kolonier som bildats i CFC-analys genom GATA2 / TAL1 / LMO2 differentierade cellsand motsvarande Wright-färgade cytospins representerande erytroid (E), makrofager (M), och Megakaryocytes (Mk). Skala barer för CFC-analys, 250 pm, för cytospins, 20 pm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Optimering av Lentiviral transduktion förfarande (A) Transduktion av H1 hESCs med olika MOI av GFP lentivirus.. (B) Cellviabilitet och differentiering effektivitet i kulturer omvandlade med GATA2 / TAL1 / LMO2 vid låg (1 för varje virus) och hög (2 för varje virus) MOI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovan beskrivna metoden för hematopoetisk differentiering av hPSCs genom överuttryck av TF representerar en snabb och effektiv metod för generering av HE och myeloid och erytho-magakaryocytic stamceller från hESCs och iPSCs, varigenom produktion av upp till 30 miljoner blodkroppar från en miljon pluripotenta stamceller 10. Denna metod uppvisade konsekvent differentiering i flera hESC och iPSCs linjerna 10. Under differentiering av ETV2 och GATA2, GATA1 faktorer samt GATA2 och TAL1 faktorer cellerna bildar blod producerar endotel, HE och genomgå en endotel till hematopoetisk övergång. Bildning av HE observeras vanligtvis mellan dag 3 och 4 av differentiering. Tillsats av LMO2, en transkriptions co-faktor TAL1, till GATA2 och TAL1 kombination, ökade signifikant robusthet av differentiering, medan HE scenen blev markant kontrakterade.
Framgången för riktad differentianing av hPSCs av transkriptionsfaktorer beror huvudsakligen på (i) en effektiv leverans av nukleinsyror in i celler, (ii) cellviabiliteten efter genetiska manipulationer, och (iii) en effektiv översättning av exogena transkript inuti cellen.
En av de viktigaste stegen i den beskrivna metoden är produktion av effektiva lentivirala enheter, vilket beror på en exakt pH för HEK 293T celltransfektion, och frånvaron av endotoxin föroreningar i alla steg av virala produktion och omvandlingsexperiment. Integriteten av alla konstruktioner, inklusive förpackningar och kuvert plasmider, måste verifieras om inga tecken på viral produktion i HEK 293T-celler observeras 13.
Differentieringen protokoll design med kombinationer av transkriptionsfaktorer bör överväga flera variabler. Hög effektivitet av viral transduktion är viktig för en framgångsrik differentiering. Eftersom transduktionseffektiviteten beror på vilken metod som används för virusproduktion och rening, optimera hPSC transduktion med användning av en GFP-lentivirusvektor rekommenderas (figur 4A). Bör verifieras viral integrering efter transduktion med användning av genomiska PCR med transgen specifika primrar (Tabell 3). Differentiering optimering bör även innefatta justering av Lentiviral koncentrationen i reaktionsblandningen. En relativt låg mängd virus, MOI av 0,5 till 1, kan inducera hPSC differentiering. Medan en högre MOI ökar effektiviteten för differentiering, ökar också celldöd (Figur 4B). Ytterligare optimering steget innefatta MOI förhållande justering för varje virus i reaktionsblandningen. I GATA2 / ETV2 omvandlade kulturer, en fördubbling av MOI för GATA2, i förhållande till ETV2, ökar effekten av differentieringen. För GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 och GATA2 / TAL1 / LMO2 lika MOI för varje virus är optimal.
Efter transduktion med TF, en stor majoritet av celler underwent angiohematopoietic differentiering medan endast ett fåtal celler behållit en odifferentierad morfologi. Eftersom PSIN-EF1a lentivirusvektorer införliva antibiotikaresistens, kan behandling av kulturer med puromycin användas för att eliminera återstående odifferentierade celler.
Bildandet av celler med karakteristiska endotelceller morfologier, och efterföljande runda blodceller, visar en framgångsrik differentiering. I genomsnitt producerar GATA2 / ETV2 kombination 40-50% av CD43 + VE-cadherin +/- blodkroppar från dag 9-10 av differentiering med upp till 30% celler kvar VE-cadherin + CD43 -. GATA1 / ETV2 kombination inducerar CD43 uttryck snabbare och alstrar ett större antal CD43 + celler jämfört med den GATA2 / ETV2 kombination. I dessa odlingar, majoriteten av CD43 + -celler samuttrycka VE-cadherin. I kulturer omvandlade med GATA2 / TAL1 antalet CD43 + celler vanligtvis når 40-50%. Tillsatsen av LMO2 till GATA2 / TAL1 avsevärt påskyndar och förbättrar blodproduktion, och markant kontrakt den endothelial utvecklingsstadium.
Kolonibildande analyser bör användas för att bestämma frekvensen och typen av inducerade hematopoietiska stamceller. Den typ av kolonibildande celler kan bekräftas genom framställning Wright-färgade cytospins från individuella kolonier. hPSCs omvandlade med ETV2 och GATA2 producerar mestadels stora (större än 0,5 mm i diameter) med hög proliferativ potential (HPP) myeloidkolonier består av omogna granulocytiska och monocytiska celler, med några mogna myeloidceller och enstaka erytroida och megakaryocytiska celler. I genomsnitt mer än 80% av CFC i GATA2 / ETV2 omvandlade kulturer är myeloida HPPs. Dessutom är dessa kulturer genererar erytroida och makrofagkolonier (fig 2E), vilka vanligtvis innefattar mindre än 20% av de totala CFC. hPSC transduktion med ETV2 och GATA1 signifikant ökar the andel av CFC-E upp till 50%. TAL1 och GATA2 transducerade kulturer producerar mestadels erytroid (mer än 80% av den totala CFC) och megakaryocytiska kolonier (mer än 10% av den totala CFC) med mycket få makrofagkolonier (mindre än 5% av den totala CFC). Tillsatsen av LMO2 till TAL1 och GATA2 kombination ökar signifikant frekvensen av kolonibildande celler med erytro-megakaryocytiska potentialen 10. Mönstret av CFC aktivitet efter transduktion med de beskrivna kombinationer av transkriptionsfaktorer är konsekvent mellan olika hESC och hiPSC linjerna 10.
Sammanfattningsvis är lentivirala medierad överuttryck i hPSCs ett relativt snabbt och effektivt verktyg för induktion av HE och blod med användning av TF: er. Detta system kan också användas för att bedöma differentiering kapacitet för andra TF och identifiera dem som krävs för endotelceller och hematopoetisk specifikation. Emellertid har det nuvarande protokollet en begränsad användbarhet för studier av extracellular signalering involverad i induktionen av HE, som den använder TF: att kringgå ytan receptormedierad signalering. Även om den nuvarande protokollet beskriver produktionen blod med hjälp av konstitutivt uttryck av en transgen kan liknande resultat erhållas med användning av modifierade mRNA 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS är en av grundarna aktieägare och konsult för Cynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
