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Chimie

マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

Published: January 26, 2016
doi:
10.3791/53589
,
1Department of Chemical and Systems Biology,Stanford University School of Medicine

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

タンパク質 – タンパク質相互作用薬（PPI）は、ほぼすべての生物学的プロセスに密接に関与しており、多くのヒト疾患にリンクされています。そのため、基礎研究、製薬業界でのPPIを対象とする大規模な努力があります。タンパク質 – タンパク質界面は平坦、通常は大きく、多くの場合、そのような部位を標的とする小分子の発見を複雑に、ポケットを欠いています。抗体を用いた代替的な標的アプローチは乏しい経口バイオアベイラビリティ、低い細胞透過性、及び生産効率の悪さに起因する制限があります。

PPIインターフェースを標的にするペプチドを使用すると、いくつかの利点を有します。ペプチドは、より高いコンホメーションの柔軟性、高い選択性を有し、一般に安価です。しかし、ペプチドは、細胞膜を横切る乏しい安定性と非効率性などの独自の制限があります。このような限界を克服するために、ペプチドの環化を行うことができます。環化は、ペプチドの選択性を改善することが実証されています、代謝安定性、および生物学的利用能。しかし、環状ペプチドの生理活性立体構造を予測することは容易ではありません。この課題を克服するために、1つの魅力的なアプローチは、すべてのバックボーン環状ペプチドは、同じ一次配列を持っているが、そのような環の大きさや位置など、その立体構造に影響を与えるパラメータが異なるた画面に集中ライブラリーをスクリーニングします。

私たちは、特定の寄生虫のPPIをターゲットバックボーン環状ペプチドのライブラリーを合成するための詳細なプロトコルを記述します。合理的な設計アプローチを使用して、我々は、活性化Cキナーゼ（LACK）のための足場タンパク質のL eishmania受容体に由来するペプチドを開発しました。我々はではなく、哺乳動物宿主ホモログで、寄生虫に保存されているLACK中の配列は、寄生虫「生存のために重要であるタンパク質のための相互作用部位を表すことができるという仮説を立てました。環状ペプチドは、反応時間を短縮し、高めるためにマイクロ波照射を用いて合成しました。効率。別のリングサイズとバックボーン環状ペプチドのライブラリーを開発することは、ほとんどの生物学的活性コンホメーションのための体系的な画面を容易にします。この方法は、環状ペプチドを合成するための一般的で、速く、容易な方法を提供します。

Introduction

タンパク質-タンパク質相互作用薬（PPI）は、細胞内シグナル伝達の細胞死1に、ほとんどの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。したがって、のPPIを標的とする基礎研究および治療用途に基本的に重要です。 PPIは、具体的かつ安定的な抗体によって調節することができるが、抗体が低いバイオアベイラビリティを製造し、持っている高価では困難です。代替的に、のPPIは、小分子によって標的とすることができます。小分子は、抗体に比べて合成が容易、安価です。しかし、彼らは比較的柔軟で、大きなタンパク質-タンパク質インターフェース2,3に比べて小さな空洞へのより良いフィット。多様な研究が単純で安価抗体よりも、小さな分子よりも柔軟であるペプチドは、タンパク質のインターフェースをバインドし、PPIは4,5を調節することができることを実証しました。グローバル治療用ペプチドの市場は2013年に150億ドルの周りに評価され、10.5％のスズメノカタビラを成長していますLLY 6。また、50以上の販売ペプチド、臨床試験の異なる段階で約270ペプチド、および高度な前臨床段階7で約400ペプチドがあります。多数のペプチドは薬として使用されているが、ペプチドがまだ乏しい生物学的利用能および安定性、細胞膜を横断中の非効率性、およびコンホメーションの柔軟性8,9を含め、広範なアプリケーションを制限するいくつかの課題を提起します。これらの欠点を克服するための一つの代替は、ローカル（D-アミノ酸およびN-アルキル化）及びグローバル（環化）制約8,10-12として異なる修飾を適用することです。これらの変更はまた、自然に発生します。例えば、シクロスポリンA、免疫抑制環状天然ペプチドは、単一のD-アミノ酸を含み、N-アルキル化修飾13,14を受けます 。

天然アミノ酸の改変は、多くの場合、ペプチドに影響を与える、例えば、D-及びN-アルキル化のようなローカルな制約を誘導します9;の生物活性。しかし、目的の配列は同じまま可能な環化は、生物学的活性を保存する可能性が高いです。環化は、異なるコンホメーションの間の平衡を低減することにより、ペプチド立体配座空間を制限するための非常に魅力的な方法です。これは通常、一つだけの機能を仲介する活性コンホメーションにペプチドを制限することにより、生物学的活性および選択性を向上させます。環化はまた、より少ない分解酵素により認識されるコンフォメーションにペプチドを保持することによってペプチドの安定性を向上させます。確かに、環状ペプチドは、それらの線形対応15-17に比べて代謝安定性、バイオアベイラビリティ、および選択性を改善していることが示されました。

いくつかのケースでは制限が生理活性コンフォメーションを達成することからペプチドを防止することができるので、環化は両刃の剣であることができます。このハードルを克服するために、集中ライブラリーは、全てのペプチドが同じプライマリsequencを持っていますEその結果、一定のファーマコフォアを合成することができます。ライブラリ内のペプチドは、その後、ほとんどの生物活性コンフォメーション9,18をスクリーニングするために、このような環の大きさと位置と、その構造に影響を与えるパラメータが異なります。

ペプチドは、溶液中で、現在より一般的ペプチド合成法であり、さらに説明される固相ペプチド合成（SPPS）アプローチの両方によって合成することができます。 SPPSは、化学変換は、合成化合物19の広い範囲を調製するためにリンカーを介して固体支持体上で実施されるプロセスです。 SPPSは、N末端に、固体支持体に結合しているC末端から段階的にアミノ酸の連続的カップリングにより集合ペプチドを可能にします。 N-αアミノ酸の側鎖は、STごとに一つのアミノ酸の付加を確実にするために、ペプチド伸長の間に使用される反応条件に安定である保護基でマスクされなければなりませんEP。最後のステップでは、ペプチドを樹脂から放出され、側鎖保護基が同時に除去されます。ペプチドが合成されている間、すべての可溶性試薬は濾過によって、ペプチド固体支持体マトリックスから除去し、それぞれのカップリング工程の終了時に洗い流すことができます。そのようなシステムでは、高濃度での試薬 ​​の大過剰が完了するまで、カップリング反応を駆動することができ、全ての合成工程は、材料20の任意の転送せずに、同じ容器内で行うことができます。

SPPSは、不完全な反応、副反応、不純な試薬、ならびに反応21を監視する困難の生産など、いくつかの制限がありますが、SPPSの利点は、ペプチド合成のための「ゴールドスタンダード」行いました。これらの利点は、その結果、非天然アミノ酸を組み込むためのオプション、自動化、容易な精製、物理的損失を最小化し、過剰な試薬の使用を含みます高収率。 SPPSは難しいシーケンス21,22、蛍光修正23、及びペプチドライブラリー24,25の合成において非常に有用であることが示されています。 SPPSはまた、このようなオリゴヌクレオチド26,27、オリゴ糖28,29、およびペプチド核酸30,31などの他のポリチェーンアセンブリのための非常に便利です。興味深いことに、いくつかの場合において、SPPSは、伝統的に、溶液32,33に形成されている小分子を合成するのに有利で ​​あることが示されました。 SPPSは、研究と教育34,35のための小規模なだけでなく、大規模で業界36〜38の両方で使用されています。

主にペプチドの合成のためのSPPS法で使用される2つの合成戦略は、ブチルオキシカルボニル（BOC）および9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）です。 SPPSのために導入された元の戦略は、rからのペプチドの側鎖保護基を除去し、切断するために強い酸性条件を必要とするBocでしたESIN。 Fmocベースのペプチド合成は、しかしながら、適度な塩基条件を利用し、酸に不安定なBocでプロトコル39に穏やかな代替手段です。 Fmocストラテジーは、酸性条件下で樹脂からペプチドを切断しながら、合成の最後の工程で除去され、直交t-ブチル（tBuで）側鎖保護を利用します。

固体支持体上のペプチド合成のための一般的な原理は、図1に示されている。N-α末端の一時的な保護基でマスクされ、最初のアミノ酸は、C末端から樹脂上にロードされます。 （ 図1、工程1）必要に応じて側鎖をマスクする半永久的保護基も使用されます。標的ペプチドの合成は、N-α-一時的保護基（ 図1、工程2）及び次の保護アミノ酸のカップリング（ 図1の脱保護の反復サイクルにより、N末端 ​​にC末端から組み立てられます</strオング>、ステップ3）。最後のアミノ酸は、（ 図1、ステップ4）にロードされた後、ペプチドを樹脂支持体から切断され、半永久的保護基は、（ 図1、ステップ5）を除去します。

図1
固相ペプチド合成を 、図1 の一般的なスキームは、N-α保護アミノ酸を、樹脂（ステップ1）にリンカーを介してカルボキシル基を用いて固定されます。所望のペプチドは、N-α（ステップ2）およびアミノ酸のカップリング（工程3）からの一時的な保護基（TPG）の脱保護の反復サイクルによりN末端にC末端から直線的に組み立てられます。合成（ステップ4）を達成した後、半永久的保護基（SPG）は、ペプチド切断（ステップ5）の間に脱保護されます。= "_空白"を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

完全なペプチド鎖を組み立てた後、環化は、いくつかの選択肢によって達成することができる：（A）頭-尾環化-これは便利な方法ですが、それは環化のための唯一の選択肢（ 図2A）、（B）環化を提供するので、限られ生物活性官能基を含む、目的の配列からのアミノ酸を使用する-しかし、これらのアミノ酸の使用を妨げることなく、アミノ酸（またはその他のビルディングブロック）を添加することにより、生物学的活性（ 図2B）、及び（C）の環化に影響を与え得ます生理活性シーケンス。それは興味（ 図2C）の配列を変更することなく、集束ライブラリーを製造することができるように、これらの分子を導入することは広く行われています。

図2
Figure 2. 代替ペプチド環化戦略尾環化（A）のヘッド、C末端およびN末端 ​​の間のペプチド結合を介して。 （B）N-するグルタミン酸/アスパラギン酸（2）、または側鎖に官能性システイン残基間のジスルフィド結合などの基（1）、又はリジンの側鎖間のアミド結合の間の環化またはC末端（3 -4）; （R0）の前と（R7）の生物活性シーケンスの後、たとえば、余分なアミノ酸またはアミノ酸誘導体または小分子を添加することにより、（C）環化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

マイクロ波支援合成は、このように有機化学変換に40,41を加速 、反応を加熱するためにマイクロ波照射を使用しています。マイクロ波化学は吸収する溶剤試薬/の能力に基づいていますマイクロ波エネルギーと42を熱に変換します。技術が広まったの前に、主要な欠点は、合成プロトコルと適切な温度と圧力のコントロール43,44のために利用可能なシステムの欠如の制御性と再現性を含めて、克服しなければなりませんでした。マイクロ波支援ペプチド合成の最初の報告は、カップリング効率および純度45の有意な改善を有するいくつかの短いペプチドを合成するための台所のマイクロ波（7-10アミノ酸）を用いて行きました。また、マイクロ波エネルギーは、鎖の凝集を減少させる副反応を減少させる、ラセミ化を制限し、すべての困難および長いシーケンス46-53に重要な結合率を改善することが示されました。

現在、固体支持体上のペプチドまたは関連化合物の合成のためのマイクロ波照射の使用は、有機溶剤54の代わりに、水（A）合成を含む、広範です。 （B）ペプチドの合成とこのような合成により、立体障害されたアミノ酸誘導体のカップリング効率が低い、典型的には困難である糖ペプチド55-58または59-61ホスホペプチドなどの一般的な翻訳後修飾、。 （C）側鎖に接続されている窒素原子62、またはペプトイドでのアミノ酸残基のC（α）の置換によって形成することができ、このようなアザペプチドなどの主鎖中に修飾を有するペプチドの合成むしろCα原子63,64よりアミド窒素; （D）環状ペプチド65-71の合成;コンビナトリアルライブラリー51,72のと（E）の合成。多数の例では、著者らは、より高い効率が報告され、従来の手順と比較して、マイクロ波照射を使用して合成時間を減少させました。

合理的な設計73-75を使用して、我々は、foを足場のL eishmaniaの受容体から誘導された抗寄生虫性ペプチドを開発Rは、Cキナーゼ（LACK）を活性化しました。 LACKは、リーシュマニア感染76の初期段階において重要な役割を果たしています。 LACKの低いレベルで発現する寄生虫はLACKが不可欠寄生虫シグナル伝達過程およびタンパク質合成78に関与しているようであっても、免疫不全マウスに77に寄生することができません。そのため、不足は重要な足場タンパク質79、貴重な薬剤標的です。ではなく、ホストの哺乳類ホモログのラックに、寄生虫に保存されている欠如配列に着目し、8アミノ酸ペプチド文化にリーシュマニア属の生存率を減少させた（RNGQCQRK）を同定しました。

ここでは、上述のLACKタンパク質配列に由来する骨格環状ペプチドの合成のためのプロトコールを記載します。ペプチドは、Fmocの/にtBuプロトコルSPPS法によってマイクロ波加熱を用いて固体支持体上で合成しました。ペプチドは、アミド結合などを介してTAT 47-57（YGRKKRRQRRR）キャリアペプチドに結合させましたSPPSの一部。細胞内への貨物の様々なTATベースのトランスポートは、15年以上にわたって使用されており、細胞内小器官への貨物の配送には80を確認されています。四つの異なるリンカー、コハク酸およびグルタル酸無水物、ならびにアジピン酸およびピメリンは、2〜5個の炭素原子のカルボン酸リンカーを生成するための環化を行うために使用されました。環化は、マイクロ波エネルギーを使用して行った、最終的な切断および側鎖脱保護工程は、マイクロ波エネルギーなしで手動で行われました。自動化されたマイクロ波シンセサイザーの使用は、生成物の純度を改善し、製品の収率が増加し、合成の持続時間を減少させました。この一般的なプロトコールは、in vitroおよびin vivoでの重要な分子機構を理解し、さらにヒト疾患のための潜在的な薬物を開発するためにペプチドを使用する他の研究に適用することができます。

Protocol

1.機器および試薬の準備準備設備適切な個人用保護具を使用して、ヒュームフード内のすべての手順を実行します。 化学的にテフロン（登録商標）反応器（ガラスフリットと30 mlの）または使い捨てのポリプロピレンマイクロ波電力供給を制御するための光ファイバ温度プローブを装備した発見の追加のモジュールをマイクロ波ペプチド合成機を用いて固体支持体上のペ?…

Representative Results

ここでは、特にリーシュマニア寄生虫の重要なのPPIを対象とし、（駆虫薬87としてのPPIを対象とするペプチドについてのレビューのために）駆虫剤として作用バックボーン環状ペプチドの集中小さなライブラリの開発について説明します。小説の骨格環状ペプチドの合成により、ファーマコフォアは、拡張可能な大きさの足場に保存されています。ここで提案されている集中ラ…

Discussion

完全に自動化されたマイクロ波合成装置を用いてリーシュマニア寄生虫の欠如タンパク質由来の骨格環状ペプチドの集中ライブラリーの合成が記載されています。環状ペプチドの集中ライブラリが保存されたファーマコフォアと様々なリンカーを開発しました。そのような無水グルタル酸、無水コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、リジン、オルニチン、および他のビルディングブロ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は有用な議論のためにローレンヴァンWassenhove、Sunhee黄、およびダリアMochly・ローゼンに感謝します。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割も持っていないNQする作品は、健康補助金NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA（SPARK）の国立研究所によってサポートされていました。

Materials

REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’- Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
Diisopropylcarbodiimide (DIC)
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Name  Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams™ nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
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References

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Keywords: Backbone Cyclic Peptide LibraryAntiparasitic TherapeuticsMicrowave IrradiationProtein-protein InteractionsAmino AcidActivatorActivator BasePolypropylene CartridgeCoupling ReactionNN-dimethylformamidePiperidine1-hydroxybenzotriazoleDichloromethane1-methyl-2-pyrrolidinoneAnhydride4-DimethylaminopyridineNN-diisopropylethylamineTrifluoroacetic AcidTriisopropylsilane
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Citer Cet Article
Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).
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