Desarrollo de un Backbone cíclica Péptido Biblioteca como Potencial Antiparasitarios Terapéutica Utilizando Microondas irradiación
Summary
A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.
Abstract
Las interacciones proteína-proteína (IBP) son íntimamente involucrado en casi todos los procesos biológicos y están vinculados a muchas enfermedades humanas. Por lo tanto, hay un esfuerzo importante para orientar los IBP en la investigación básica y en la industria farmacéutica. Proteína-proteína interfaces suelen ser grandes, planas, ya menudo carecen de los bolsillos, lo que complica el descubrimiento de pequeñas moléculas que se dirigen a tales sitios. Enfoques alternativos de focalización utilizando anticuerpos tienen limitaciones debido a la mala biodisponibilidad oral, baja permeabilidad celular, y la ineficiencia de la producción.
El uso de péptidos para apuntar interfaces de PPI tiene varias ventajas. Los péptidos tienen una mayor flexibilidad conformacional, el aumento de la selectividad, y son generalmente de bajo costo. Sin embargo, los péptidos tienen sus propias limitaciones incluida la mala estabilidad y la ineficiencia de cruzar las membranas celulares. Para superar estas limitaciones, la ciclación del péptido se puede realizar. La ciclación se ha demostrado para mejorar la selectividad de péptidos, La estabilidad metabólica y biodisponibilidad. Sin embargo, la predicción de la conformación bioactiva de un péptido cíclico no es trivial. Para superar este reto, un enfoque atractivo para cribar una biblioteca enfocada a la pantalla en la que todos los péptidos con esqueleto cíclico tienen la misma secuencia primaria, pero se diferencian en los parámetros que influyen en su conformación, tales como el tamaño del anillo y la posición.
Se describe un protocolo detallado para la síntesis de una biblioteca de péptidos cíclicos de cadena principal de orientación IBP parásitos específicos. Utilizando un enfoque de diseño racional, hemos desarrollado péptidos derivados de la proteína andamio receptor L eishmania para C-quinasa activada (LACK). La hipótesis de que las secuencias en la carencia que se conservan en los parásitos, pero no en el homólogo huésped de mamífero, pueden representar sitios de interacción de las proteínas que son críticos para la viabilidad de los parásitos. Los péptidos cíclicos se sintetizaron utilizando irradiación de microondas para reducir los tiempos de reacción y aumentareficiencia. El desarrollo de una biblioteca de péptidos cíclicos backbone con diferentes tamaños de anillos facilita una pantalla sistemático para la conformación activa más biológica. Este método proporciona un modo general, rápido y fácil para sintetizar péptidos cíclicos.
Introduction
Interacciones proteína-proteína (IBP) desempeñan un papel fundamental en la mayoría de los procesos biológicos, de transducción de señales intracelulares a la muerte celular 1. Por lo tanto, la orientación IBP es de fundamental importancia para la investigación básica y las aplicaciones terapéuticas. IBP pueden ser reguladas por anticuerpos específicos y estables, pero los anticuerpos son caros y difíciles de fabricar y tienen una escasa biodisponibilidad. Alternativamente, los IBP pueden ser dirigidos por pequeñas moléculas. Las moléculas pequeñas son más fáciles de sintetizar y de bajo costo en comparación con los anticuerpos; sin embargo, son relativamente menos flexible y se adaptan mejor a las pequeñas cavidades que a grandes proteína-proteína interfaces 2,3. Diversos estudios han demostrado que los péptidos, que son más simples y más baratos que los anticuerpos y más flexible que las moléculas pequeñas, se pueden unir las interfaces de proteínas y regular los IBP 4,5. El mercado global de péptido terapéutico fue valorada alrededor de quince mil millones de dólares en 2013 y crece un 10,5% annually 6. Además, hay más de 50 péptidos comercializados, alrededor de 270 péptidos en diferentes fases de los ensayos clínicos, y alrededor de 400 péptidos en fases preclínicas avanzadas 7. Aunque numerosos péptidos se utilizan como fármacos, péptidos todavía plantean varios retos que limitan su aplicación generalizada incluyendo escasa biodisponibilidad y estabilidad, la ineficiencia en las membranas celulares de cruce, y la flexibilidad conformacional 8,9. Una alternativa para superar estos inconvenientes es aplicar diferentes modificaciones tales como las limitaciones 8,10-12 (D-aminoácido y N-alquilación) local y global (ciclación). Estas modificaciones también se producen naturalmente. Por ejemplo, la ciclosporina A, un péptido natural cíclico inmunosupresor, contiene un solo D-aminoácido y se somete a modificaciones N-alquilación 13,14.
La modificación de los aminoácidos naturales para inducir limitaciones locales, tales como D- y N-alquilación, a menudo afecta el péptido9; s actividad biológica. Sin embargo, la ciclación, en la que la secuencia de interés puede seguir siendo el mismo, es más probable para preservar la actividad biológica. La ciclación es una forma muy atractiva para restringir el espacio conformacional del péptido mediante la reducción del equilibrio entre diferentes conformaciones. Por lo general, aumenta la actividad biológica y la selectividad al restringir el péptido a la conformación activa que media una sola función. La ciclación también mejora la estabilidad del péptido manteniendo el péptido en una conformación que es menos reconocido por enzimas de degradación. De hecho, se muestran péptidos cíclicos que han mejorado la estabilidad metabólica, biodisponibilidad, y la selectividad en comparación con sus homólogos lineales 15-17.
Sin embargo, la ciclación puede ser una espada de doble filo ya que en algunos casos, la restricción puede evitar que los péptidos de alcanzar una conformación bioactiva. Para superar este obstáculo, una biblioteca centrada en el que todos los péptidos tienen la misma sequenc primariae y, en consecuencia constantes farmacóforos pueden ser sintetizados. Los péptidos de la biblioteca difieren en los parámetros que influyen en su estructura, tales como el tamaño del anillo y la posición, con el fin de detectar posteriormente para la conformación más bioactivo 9,18.
Los péptidos se pueden sintetizar tanto en solución como por un enfoque de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), que es ahora el enfoque de síntesis de péptidos más prevalente y se tratará más adelante. SPPS es un proceso por el cual las transformaciones químicas se llevan a cabo sobre un soporte sólido mediante un enlazador para preparar una amplia gama de compuestos sintéticos 19. SPPS permite el montaje de péptidos por acoplamiento consecutivo de los aminoácidos en una manera escalonada desde el C-terminal, que está unido a un soporte sólido, a la N-terminal. Las cadenas laterales de ácido N-alfa-amino deben ser enmascarados con grupos protectores que son estables en las condiciones de reacción utilizadas durante la elongación del péptido para garantizar la adición de un aminoácido por step. En el paso final, el péptido se libera de la resina y los grupos protectores de cadena lateral se eliminan de forma concomitante. Mientras se sintetiza el péptido, todos los reactivos solubles se pueden eliminar de la matriz de soporte-péptido sólido por filtración y se lavaron lejos en el final de cada etapa de acoplamiento. Con un sistema de este tipo, un gran exceso de reactivos en una concentración elevada puede conducir reacciones de acoplamiento hasta su finalización y todos los pasos de síntesis se puede realizar en el mismo recipiente sin ninguna transferencia de material 20.
Aunque SPPS tiene algunas limitaciones, tales como la producción de reacciones incompletas, las reacciones secundarias, reactivos impuros, así como las dificultades de seguimiento de la reacción 21, las ventajas de SPPS han convertido en el "estándar de oro" para la síntesis de péptidos. Estas ventajas incluyen la opción de incorporar aminoácidos no naturales, la automatización, la purificación fácil, pérdidas físicas minimizadas, y el uso de reactivos en exceso, resultando enaltos rendimientos. SPPS ha demostrado ser extremadamente útil en la síntesis de secuencias difíciles 21,22, modificaciones fluorescentes 23, y bibliotecas de péptidos 24,25. SPPS también es muy útil para otros conjuntos de poli-cadena tales como oligonucleótidos, oligosacáridos 28,29 26,27, y ácidos nucleicos peptídicos 30,31. Curiosamente, en algunos casos, SPPS ha demostrado ser ventajoso para la síntesis de moléculas pequeñas que se hacen tradicionalmente en solución 32,33. SPPS se utiliza tanto en pequeña escala para la investigación y la enseñanza 34,35, así como a gran escala en la industria 36-38.
Dos estrategias de síntesis que se utilizan principalmente en la metodología de SPPS para la síntesis de péptidos son butiloxicarbonilo (Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). La estrategia original introducido para SPPS era Boc, que requiere condiciones de ácido fuerte para eliminar de la cadena lateral y grupos protectores de escindir el péptido de la rEsin. La síntesis de péptidos basada en Fmoc, sin embargo, utiliza las condiciones de base moderada y es una alternativa más suave para el protocolo Boc lábil al ácido 39. La estrategia Fmoc utiliza ortogonal t-butilo (tBu) la protección de la cadena lateral que se elimina en la última etapa de la síntesis, mientras que la escisión del péptido de la resina en condiciones ácidas.
El principio general para la síntesis de péptidos sobre un soporte sólido se presenta en la Figura 1. El aminoácido inicial, enmascarado por un grupo protector temporal en el N-α-terminal, se carga en la resina de la C-terminal. Un grupo protector semi-permanente para enmascarar la cadena lateral también se utiliza si es necesario (Figura 1, Paso 1). La síntesis del péptido diana se ensambla a partir de la C-terminal a la N-terminal por ciclos repetitivos de desprotección del grupo protector de N-α-temporal (Figura 1, paso 2) y el acoplamiento del siguiente aminoácido protegido (Figura 1 </str ong>, Paso 3). Después de que el último aminoácido se carga (Figura 1, Etapa 4), el péptido se escinde del soporte de resina y los grupos protectores semipermanentes se eliminan (Figura 1, paso 5).
Figura 1. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida. El aminoácido protegido con N-α se ancla mediante el grupo carboxilo a través de un enlazador a la resina (Paso 1). El péptido deseado se ensambla de forma lineal desde el extremo C-terminal a la N-terminal por ciclos repetitivos de desprotección del grupo protector temporal (TPG) de la N-α (Paso 2) y el acoplamiento de aminoácidos (Paso 3). Después de lograr la síntesis (Paso 4), los grupos protectores semi-permanentes (SPG) se desprotegen durante la escisión del péptido (Paso 5).conseguir = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Después del montaje de la cadena peptídica completa, ciclación se puede lograr mediante varias alternativas: (A) de cabeza a cola ciclación – Esta es una manera conveniente, pero limitado, ya que proporciona una única opción para la ciclación (Figura 2 A), (B) ciclación utilizando los aminoácidos de la secuencia de interés que contienen grupos funcionales bioactivos – sin embargo, el uso de estos aminoácidos puede influir en la actividad biológica (Figura 2B), y (C) ciclación mediante la adición de aminoácidos (u otros bloques de construcción) sin perturbar la secuencia bioactivo. La introducción de estas moléculas está muy extendida, ya que permite la producción de bibliotecas enfocadas sin modificar la secuencia de interés (Figura 2C).
Figura 2. estrategias de ciclación de péptidos Alternativa (A) la cabeza a la cola de ciclación, a través de un enlace peptídico entre el C-terminal y N-terminal.; (B) ciclación entre los grupos funcionales tales como un enlace disulfuro entre residuos de cisteína (1), o un enlace amida entre las cadenas laterales de lisina para aspártico / ácido glutámico (2), o cadena lateral a N- o C-terminal (3 -4); (C) ciclación mediante la adición de aminoácidos adicionales o derivados de aminoácidos o moléculas pequeñas, por ejemplo antes (R0) y después (R7) la secuencia bioactiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Asistida por microondas síntesis utiliza irradiación de microondas para calentar reacciones, acelerando así química orgánica Transformaciones 40,41. La química de microondas se basa en la capacidad del reactivo / disolvente para absorber elmicroondas energía y convertirla en calor 42. Antes de que la tecnología se generaliza, los principales inconvenientes tuvieron que superar, incluyendo la capacidad de control y reproducibilidad de los protocolos de síntesis y la falta de sistemas disponibles para temperatura y presión adecuados controles 43,44. El primer informe de síntesis de péptidos asistida por microondas se hizo usando un microondas cocina para sintetizar varios péptidos cortos (7-10 aminoácidos) con una mejora significativa de la eficiencia de acoplamiento y pureza 45. Por otra parte, la energía de microondas se demostró que disminuir la agregación de la cadena, reducir las reacciones laterales, limitar la racemización, y mejorar las tasas de acoplamiento, que son todos críticos para las secuencias difíciles y largas 46-53.
Actualmente el uso de irradiación de microondas para la síntesis de péptidos o compuestos relacionados en un soporte sólido es extensa, incluyendo (A) la síntesis en agua en lugar de disolvente orgánico 54; (B) la síntesis de péptidos conmodificaciones post-traduccionales comunes, tales como glicopéptidos 55-58 o 59-61 fosfopéptidos, cuya síntesis es típicamente difícil debido a la baja eficiencia de acoplamiento de derivados de ácido amino estéricamente impedidos; (C) la síntesis de péptidos con modificación en la columna vertebral, tales como azapeptides, que pueden formarse por la sustitución de la C (α) de un residuo de aminoácido con un átomo de nitrógeno 62, o peptoides, cuya cadena lateral está conectada a la nitrógeno de la amida en lugar del átomo de Cα 63,64; (D) la síntesis de péptidos cíclicos 65-71; y (E) la síntesis de bibliotecas combinatorias 51,72. En numerosos casos, los autores informaron una mayor eficiencia y reducido tiempo de síntesis usando irradiación de microondas en comparación con el protocolo convencional.
El uso de un diseño racional 73-75, desarrollamos péptidos anti-parasitarios que se derivaron de los receptores del andamio L de eishmania for activa C-quinasa (FALTA). FALTA juega un papel importante en la fase temprana de la infección por Leishmania 76. Los parásitos que expresan niveles más bajos de FALTA fallan en parasitar incluso ratones inmunocomprometidos 77 como FALTA está involucrado en procesos de parásitos señalización esenciales y la síntesis de proteínas 78. Por lo tanto, FALTA es una proteína andamio clave 79 y una diana farmacológica valioso. Centrándose en las secuencias en la carencia que se conservan en los parásitos, pero no en el huésped mamífero RACK homólogo, hemos identificado un péptido de 8 aminoácidos (RNGQCQRK) que la disminución de Leishmania sp. Viabilidad en cultivo.
Aquí, se describe un protocolo para la síntesis de la cadena principal cíclica péptidos derivados de la secuencia de proteína LACK descrito anteriormente. Los péptidos se sintetizaron en un soporte sólido usando calentamiento por microondas mediante la metodología de SPPS con Fmoc protocolo / tBu. Los péptidos se conjugan con un péptido 47-57 de soporte (YGRKKRRQRRR) TAT a través de un enlace amida comoparte de la SPPS. Transporte basado en TAT de una variedad de cargas en las células ha sido utilizado durante más de 15 años y la entrega de la carga en orgánulos subcelulares se ha confirmado 80. Cuatro enlazadores diferentes, succínico y anhídrido glutárico, así como adípico y ácido pimélico, fueron utilizados para realizar la ciclación para generar enlazadores de ácido carboxílico de dos a cinco carbonos. La ciclación se realizó utilizando energía de microondas, y la división y de la cadena lateral pasos finales de desprotección se realizaron manualmente sin energía de microondas. El uso de un sintetizador automático de microondas mejoró la pureza del producto, aumenta el rendimiento del producto, y redujo la duración de la síntesis. Este protocolo general se puede aplicar a otros estudios que utilizan péptidos de entender importante mecanismo molecular in vitro e in vivo y desarrollar fármacos potenciales para enfermedades humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La síntesis de una biblioteca enfocada de péptidos cíclicos de cadena principal derivadas de la proteína LACK del parásito Leishmania utilizando un sintetizador de microondas completamente automatizado se describe. Una biblioteca enfocada de péptidos cíclicos se desarrolló con farmacóforos conservados y varios conectores. La adición de varios enlazadores tales como anhídrido glutárico, anhídrido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, lisina, ornitina, y otros bloques de construcción se pue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang, y Daria Mochly-Rosen útil para los debates. El trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) para NQ Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| REAGENTS | |||
| Solid support, Rink Amide AM resin ML | CBL | BR-1330 | loading: 0.49 mmol/g |
| Fmoc-Ala-OH | Advanced Chemtech | FA2100 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Advanced Chemtech | FR2136 | |
| Fmoc-Asn(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FN2152 | |
| Fmoc-Asp(OBut)-OH | Advanced Chemtech | FD2192 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FC2214 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FQ2251 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Advanced Chemtech | FE2237 | |
| Fmoc-Gly-OH | Advanced Chemtech | FG2275 | |
| Fmoc-His(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FH2316 | |
| Fmoc-Ile-OH | Advanced Chemtech | FI2326 | |
| Fmoc-Leu-OH | Advanced Chemtech | FL2350 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FK2390 | |
| Fmoc-Met-OH | Advanced Chemtech | FM2400 | |
| Fmoc-Phe-OH | Advanced Chemtech | FF2425 | |
| Fmoc-Pro-OH | Advanced Chemtech | FP2450 | |
| Fmoc-Ser-(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FS2476 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FT2518 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FW2527 | |
| Fmoc-Tyr(But)-OH | Advanced Chemtech | FY2563 | |
| Fmoc-Val-OH | Advanced Chemtech | FV2575 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma | 328634 | Caution Toxic/Highly flammable/Irritant. |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Alfa Aesar | 43465 | Caution Toxic |
| Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition. | |||
| Dichloromethane (DCM) | Sigma | D65100 | Caution Harmful |
| Dibromomethane (DBM) | Sigma | D41868 | Caution Harmful |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | T62200 | Caution Corrosive/Toxic |
| Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) | Sigma | 91707 | Caution Corrosive/Toxic |
| Diethylether | Sigma | 31690 | Caution Highly flammable/Harmful |
| Triisopropylsilane (TIS) | Sigma | 233781 | Caution Irritant/Flammable |
| Water, HPLC grade | Sigma | 270733 | |
| Acetonitroile, HPLC grade (ACN) | Fisher Scientific | A998-4 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) | Sigma | 3440 | Caution Corrosive/Highly flammable |
| Piperidine | Sigma | W290807 | Caution Toxic/Highly flammable |
| Pyridine | Sigma | 270970 | Caution Highly flammable/Harmful |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | 459844 | Caution Highly flammable/Irritant |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) | Sigma | 157260 | Caution Highly flammable/Irritant/Harmful |
| O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Sigma | 12804 | Caution Irritant/Harmful |
| Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) | Advanced Chemtech | RC8602 | Caution Irritant |
| Ninhydrin | Sigma | 454044 | Caution Harmful |
| Phenol | Sigma | P3653 | Caution Corrosive/Toxic |
| Potassium cyanide (KCN) | Sigma | 11813 | Caution Very Toxic |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 221473 | Caution Toxic |
| N,N’- | Sigma | 38370 | Caution Flammable/ Toxic |
| Diisopropylcarbodiimide (DIC) | |||
| 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma | 522805 | Caution Toxic/Irritant |
| Glutaric anhydride | Sigma | G3806 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
| Succinic anhydride | Sigma | 239690 | Caution Irritant/Harmful |
| Adipic acid | Sigma | A26357 | Caution Toxic/Irritant |
| Pimelic acid | Sigma | P45001 | Caution Toxic/Irritant |
| Chloranil | Sigma | 23290 | Caution Toxic/Irritant |
| Acetaldehyde | Sigma | 402788 | Caution Flammable/ Toxic |
| EQUIPMENT | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R centrifuge | |
| Lyophilizer | Labconco | freezone 4.5 | |
| Vacuum pump | Franklin Electric | model 1101101416 with 3/4 HP | Alcatel pump with Franklin Motor |
| Polypropylene cartridge 12 ml | Applied Separation | 2419 | |
| Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8157 | |
| Polypropylene cartridge 3 ml | Applied Separation | 2413 | |
| Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8054 | |
| Stop cocks PTFE | Applied Separation | 2406 | |
| Tubes flat, 50 ml | VWR | 21008-240 | |
| Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes | Waters | WAT200609 | |
| Shaker, BD adams™ nutator mixer | Fisher scientific | 22363152 | |
| Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml | Fisher scientific | 03-312-8 | |
| Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB-501, 500 ml | |
| Heating block | Thermolyne | 1760 dri bath | |
| Disposable borosilicate glass tubes with plain end | Fisher Scientific | 14-961-25 | |
| Micropipettes and tips Finnpipette | Thermo | 20–200 and 100–1,000 μl | |
| HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100 | VWR | 69400-124 | |
| HPLC vial- Blue Snap-It Cap | VWR | 66030-600 | |
| Analytical HPLC column | Peeke Scientific | U1-5C18Q-JJ | ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm |
| Prep HPLC column, XBridge | Waters | OBD C18 5 µm column | 19 mm × 150 mm |
| Mass spectrometer | Applied Biosystems | Voyager DE-RP |
References
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