JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Published: January 26, 2016
doi:
10.3791/53589
,
1Department of Chemical and Systems Biology,Stanford University School of Medicine

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

Protein-protein etkileşimleri (PPIs) hemen hemen tüm biyolojik süreçlerin neden olduklarına ve birçok insan hastalıkları ile bağlantılıdır. Bu nedenle, temel araştırma ve ilaç sektöründe PPIs hedef büyük bir çaba var. Protein-protein arayüzleri düz, genellikle büyük ve genellikle bu tür siteleri hedeflemek küçük moleküllerin keşfi zorlaştıran, cepler yoksundur. Antikorlar kullanılarak alternatif hedefleme yaklaşımları kötü oral biyoyararlanım, düşük hücre geçirgenliği ve üretim verimsizliği nedeniyle sınırlamaları vardır.

PPI arayüzleri hedef peptidleri kullanma birçok avantajı vardır. Peptitler daha şekilsel esnekliğe, artan seçiciliğe sahip ve genellikle daha ucuzdur. Ancak, peptidler yoksul istikrar ve verimsizlik geçen hücre zarları da dahil olmak üzere, kendi sınırlamaları vardır. Bu tür kısıtlamaların üstesinden gelebilmek için, peptit siklizasyon yapılabilir. Siklizasyon peptid seçimliliği arttırmak için ortaya konmuşturMetabolik stabilitesi ve biyo. Bununla birlikte, bir siklik peptid konformasyonunu biyoaktif tahmin önemsiz değildir. Bu sorunun üstesinden gelebilmek için, bir çekici bir yaklaşım tüm omurga siklik peptitler aynı birincil sekansına sahiptir, ancak bu tür bir halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklı olan ekrana odaklanmış bir kütüphanenin taranması için.

Spesifik parazit PPIs hedefleme omurgası siklik peptidlerin bir kütüphane sentezi için detaylı bir protokol açıklar. Rasyonel bir tasarım yaklaşımı kullanarak, aktive C-kinaz (EKSİKLİĞİ) için iskele protein L eishmania reseptörü türetilen peptidler geliştirdi. Biz ancak memeli konak homolog olarak, parazitler korunan LACK diziler, parazitlerin canlılığı açısından kritik olan proteinler için etkileşim siteleri temsil edebilir varsaydık. Halkalı peptidler reaksiyon sürelerini azaltmak ve artırmak için mikrodalga ışıması kullanılarak sentezlendiverimlilik. Farklı halka boyutları ile omurgası halkalı peptidler bir kütüphane geliştirilmesi en Biyolojik aktif konformasyon için sistematik bir ekran kolaylaştırır. Bu yöntem, döngüsel peptitler sentezlemek için bir genel, hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Introduction

Protein-protein etkileşimleri (PPIs), hücre içi sinyal iletimine hücre ölümüne 1, en ​​çok biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, PPIs hedefleyen temel araştırma ve tedavi uygulamaları temel bir öneme sahiptir. PPI'lar özel ve stabil antikor ile düzenlenir, ancak antikorlar üretmek ve zayıf biyoyararlanıma sahip pahalı ve zordur edilebilir. Alternatif olarak, PPIs küçük moleküller ile hedeflenebilir. Küçük moleküller, antikorlar ile karşılaştırıldığında sentezlenmesi daha kolay ve ucuzdur; ancak, görece daha az esnek ve geniş protein-protein arayüzleri 2,3 daha küçük boşluklara daha iyi uyum. Çeşitli çalışmalar, basit ve ucuz bir antikor daha küçük moleküllere göre daha esnek olan peptidler, protein arabirimleri bağlanan ve PPIs 4,5 düzenleyebildiğini göstermiştir. Küresel tedavi peptid pazarı 2013 yılında 15000000000 dolar civarında değer ve% 10,5 annua büyüyorLly 6. Ayrıca, 50'den fazla pazarlanan peptidler, klinik test farklı aşamalarında yaklaşık 270 peptidler ve gelişmiş klinik öncesi safhalarında 7 yaklaşık 400 peptidler vardır. Çok sayıda peptidler ilaç olarak kullanılmaktadır rağmen, peptidler hala zayıf biyoyararlanım ve istikrar, geçiş hücre zarlarında verimsizlik ve yapısal esneklik 8,9 dahil olmak üzere yaygın bir uygulama sınırlayan birçok zorluklar oluşturmaktadır. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için bir seçenek, örneğin, yerel (D-amino asit ve N-alkilasyon) ve küresel (siklizasyon) sınırlamaların 8,10-12 gibi farklı modifikasyonlar uygulamaktır. Bu modifikasyonlar, aynı zamanda doğal olarak meydana gelir. Örneğin, siklosporin A, bir bağışıklık bastırıcı doğal siklik peptit, tek bir D-amino asit içerir ve N-alkilasyon modifikasyonlar 13,14 geçer.

Doğal amino asitlerin değiştirilmesi, genellikle peptid etkiler, örneğin D- ve N-alkilasyon gibi lokal kısıtlamaları indükleme9'un s biyolojik etkinliği. Bununla birlikte, ilgi konusu sekans aynı kalır hangi siklizasyon, biyolojik aktiviteyi korumak için daha olasıdır. Siklizasyon farklı konformasyonları arasındaki dengeyi azaltarak peptid yapısal alanı kısıtlamak için son derece cazip bir yoldur. Genellikle tek bir işlevine aracı olan aktif yapının peptidi kısıtlayarak, biyolojik aktivite ve seçicilik arttırır. Siklizasyon ayrıca daha az bozucu enzimler tarafından tanınan bir konformasyonda peptid tutarak, peptid stabilitesini artırır. Gerçekten de, siklik peptitler, linear karşıt parçalarına göre 15-17 metabolik dayanıklılık, biyoyararlanımını ve seçicilik geliştirilmiş gösterildi.

Ancak, siklizasyon bazı durumlarda kısıtlama biyoaktif bir yapıyı elde peptidler engelleyebilir çünkü iki ucu keskin kılıç olabilir. Bu engel aşmak için, odaklanmış bir kütüphane olduğu tüm peptidler aynı birincil sequenc vare ve sonuç olarak sabit bir farmakoforlar sentezlenebilir. Kütüphanede peptidler için, daha sonra biyolojik olarak aktif en konformasyon 9,18 taranması için, ki böyle halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklıdır.

Peptitler çözelti içinde ve şimdi daha yaygın peptid sentez yaklaşımı ve daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır, bir katı-faz peptid sentezi (SPPS) yaklaşımı, her iki sentezlenebilir. SPPS kimyasal transformasyonlar sentetik bileşikler 19 geniş bir yelpazede hazırlamak için bir bağlayıcı yoluyla katı bir destek üzerinde gerçekleştirildiği bir işlemdir. SPPS N-terminine bir katı desteğe bağlı olan C-terminaline, bir aşamalı bir şekilde amino asitlerin birbirini takip eden eşleştirme işlemi ile montaj peptidler sağlar. N-α-amino asit yan zincirler st için bir amino asidin ilave edilmesini sağlamak için peptid uzama sırasında kullanılan reaksiyon koşullarında kararlı olan koruyucu gruplar ile maskelenmiş olması gerekirep. Son aşamada, peptid reçineden serbest bırakılır ve koruyucu gruplar yan zincir eş zamanlı olarak giderilir. Peptid sentez edilirken, her karbodiimit süzme ile peptid-katı destek matrisinden çıkarıldı ve her bir bağlantı adımının sonunda yıkanmasını edilebilir. Bu tür bir sistem ile, yüksek bir konsantrasyonda reaktifler, büyük miktarda tamamlanması için birleştirme reaksiyonları tahrik ve tüm sentez aşamalar, malzemenin 20 arasında transfer olmadan aynı kap içinde gerçekleştirilebilir.

SPPS bu reaksiyon 21 izleme tamamlanmamış reaksiyonlar, yan reaksiyonların ürünleri, saf olmayan reaktifler yanı sıra zorluklar üretimi gibi bazı sınırlamalar vardır, ancak, SPPS avantajları peptid sentezi için "altın standart" hale getirmiştir. Bu avantajlar elde doğal olmayan amino asitler, otomasyon, kolay saflaştırmaya birleştirmek için bir seçenek, en aza fiziksel kayıp, ve fazla reaktifler kullanılmasını içeriryüksek verim. SPPS zor sekuenzler 21,22, floresan modifikasyonlar 23 ve peptid kütüphanelerinin 24,25 sentezinde, son derece faydalı olduğu gösterilmiştir. SPPS ayrıca oligonükleotidler 26,27, 28,29 oligosakaritlerin ve peptid nükleik asitler 30,31 gibi diğer poli zincirli montajlar için çok yararlıdır. İlginç bir şekilde, bazı durumlarda, SPPS geleneksel çözelti 32,33 yapılır küçük moleküllerin sentezi için avantajlı olduğu gösterilmiştir. SPPS sektöründe 36-38 araştırma ve öğretim 34,35 için küçük ölçekli hem de büyük ölçekte hem de kullanılır.

Esas olarak Peptidlerin sentezi için SPSS metodoloji kullanılır iki sentez stratejileri bütiloksikarbonil (Boc) ve 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) 'dir. SPPS'si için kişiye ilk strateji r peptidin grupları Yan-zincir koruma kaldırma ve parçalamak için güçlü asit koşulları gerektirir Boc olduğuEsin. Fmoc-temelli peptit sentez, ancak, orta dereceli bir baz koşulları kullanır ve asit-labil Boc protokolü 39 daha yumuşak bir alternatiftir. Fmoc stratejisi asit koşulları altında, peptidin reçineden ayrılması sırasında sentezin son aşamasında uzaklaştırılır ortogonal t-butil (tBu) yan zincir koruma kullanmaktadır.

Katı bir destek üzerinde peptit sentezi için genel çalışma prensibi Şekil 1 'de sunulmuştur. N-α-terminalinde bir geçici koruyucu grup ile maskelenen başlangıç ​​amino asidi, C-terminali reçineye yüklenir. (Şekil 1, Aşama 1) gerektiğinde yan zinciri maskelemek için bir yarı kalıcı koruyucu grup, aynı zamanda kullanılır. Hedef peptidin sentezi N-α-geçici koruyucu grubun korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler aşağıdaki korumalı amino asit (Şekil 1, Aşama 2) ve bağlantı (Şekil 1 ile N-terminine C-termininden monte edilir </str Ong>, Aşama 3). Son amino asit (Şekil 1, Aşama 4) yüklendikten sonra, peptit reçine desteğinden ayrılmaktadır ve yarı kalıcı koruyucu-gruplar (Şekil 1, Aşama 5) çıkarılır.

figür 1
Katı fazlı peptid sentezi Şekil 1. genel şema. N-α-korumalı amino asit reçinesi (Aşama 1) bir bağlayıcı vasıtasıyla bir karboksil grubuna kullanılması ile tespit edilir. Istenen peptit N-a (Aşama 2) ve amino asit bağlama (Aşama 3) geçici koruma grubu (TPG) korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler ile N-terminine C-terminaline kadar olan bir doğrusal tarzda monte edilir. Sentezi (Aşama 4) tamamladıktan sonra, yarı-kalıcı koruyucu-gruplar (SPG) peptidi yarılması (Aşama 5) boyunca kaldırılır.= "_ blank" olsun> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu siklizasyon (Şekil 2A) için tek seçenek, (B) halkalanmaya sağlar çünkü bu uygun bir yoldur, ancak sınırlı – (A) baş-kuyruk siklizasyonuyla: Tüm peptit zincirinin toplanması ardından, siklizasyon çeşitli alternatifler elde edilebilir Biyolojik olarak aktif fonksiyonel gruplar ihtiva ilgi sekansından amino asitleri – ancak bu amino asitlerin kullanımı bozmadan amino asit (ya da diğer yapı taşları) ile biyolojik aktivitesi (Şekil 2B) ve (C) siklizasyonunu etkileyebilir Biyolojik olarak aktif dizisi. Bu ilgi duyulan dizilimi (Şekil 2C) değiştirmeden odaklı kütüphanelerin üretilmesine imkan verir olarak bu molekülleri tanıtılması yaygındır.

Şekil 2,
FŞEKIL 2. Alternatif peptit siklizasyon stratejilerinin C-terminal ve N-terminal arasında bir peptid bağı vasıtasıyla kuyruk siklizasyon (A) kafası.; Fonksiyonel gruplar arasında, (B) siklizasyon örneğin / glutamik asit (2) ya da yan zincir N- ya da C-ucu (3 aspartik sistein artığı (1), ya da lizin yan zincirleri arasında bir amid bağı arasında bir disülfid bağı olarak -4); (R0) öncesi ve (R7) biyoaktif dizisi sonra, örneğin ekstra amino asitler ya da amino asit türevleri ya da küçük moleküller ekleyerek (C) siklizasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Mikrodalga destekli böylece organik kimyasal hızlandırıcı, sentez reaksiyonlarını ısıtmak için mikrodalga ışıması kullanan 40,41 dönüşümler. Mikrodalga kimyası absorbe çözücü reaktif yeteneği / dayanmaktadırmikrodalga enerjisi ve dönüştürmek 42 ısıtmak için. Teknoloji yaygınlaşmadan önce, önemli dezavantajları kontrol edilebilirlik ve sentez protokolleri tekrarlanabilirlik ve yeterli sıcaklık ve basınç kontrolleri 43,44 mevcut sistemlerin eksikliği de dahil olmak üzere, aşılması gerekiyordu. Mikrodalga destekli peptid sentezi ilk rapor birleştirme verimlilik ve saflıkta 45 arasında önemli bir gelişme ile birkaç kısa peptidlerin sentezlenmesi için bir mutfak mikrodalga (7-10 amino asit) kullanılarak yapıldı. Ayrıca, mikrodalga enerjisi, zincir agregasyonunu azaltmak yan tepkimeleri azaltmak rasemizasyon sınırlandırılması ve tüm zor ve uzun sekanslar 46-53 için kritik olan birleştirme oranlarını geliştirdiği gösterilmiştir.

Şu anda, bir katı destek üzerinde peptitler veya ilgili bileşiklerin sentezi için mikrodalga ışınlama kullanılması, bir organik çözücü 54 yerine su içinde (A) sentezi de dahil olmak üzere, geniş; (B) peptitlerin sentezi ileBu tür sentez, sterik olarak engellenmiş bir amino asit türevlerinin, düşük bağlanma verimliliği tipik olarak zordur glikopeptidler 55-58 veya 59-61 phosphopeptides, ortak post-translasyonel modifikasyonlar; (C) olan bir yan zincir ile bağlı olan bir azot atomu 62 veya peptoidler, bir amino asit kalıntısının C (α) değiştirilmesi ile oluşturulabilir örneğin azapeptides olarak omurgasındaki modifikasyon ile peptidler, sentezi yerine Ca'sına atomu 63,64 daha amid nitrojen; (D) siklik peptit 65-71 sentezi; birleşimsel kütüphanelerin 51,72 ve (E) sentezi. Birçok durumda, yazarlar daha yüksek verim rapor geleneksel protokole göre, mikrodalga ışıma altında sentez süresini düşürmüştür.

Rasyonel tasarımı 73-75 kullanarak, fo skafold L eishmania en reseptörden elde edildi, anti-parazitik peptidleri gelişmişr C-kinaz (EKSİKLİĞİ) aktif. LACK Layişmanya enfeksiyonu 76 erken fazında önemli bir rol oynar. LACK düşük seviyelerde ifade Parazitler EKSİKLİĞİ temel parazit sinyal süreçleri ve protein sentezinde 78 katılır bile immün tehlikeye farelere 77 parasitize başarısız. Bu nedenle, EKSİKLİĞİ önemli bir iskele protein 79 ve değerli bir ilaç hedefidir. Ancak ev sahibi memeli benzerinin RACK olarak, parazitler korunan LACK diziler üzerinde yoğunlaşırken, biz 8 amino asit peptid kültüründe Leishmania sp. Canlılığını azalma (RNGQCQRK) belirledi.

Burada, yukarıda tarif edilen LACK proteini dizisi elde omurgası siklik peptit sentezi için bir protokol açıklar. Peptidler, Fmoc / tBu protokolü ile SPSS metodolojisine göre mikro dalga ısıtma kullanılarak katı bir destek üzerinde sentezlendi. Peptidler, bir amid bağı olarak aracılığıyla bir TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) taşıyıcı peptide konjuge edildiSPPS'si parçası. Hücre içine yüklerin çeşitli TAT merkezli ulaşım 15 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve hücre içi organellere içine kargo teslim 80 teyit edilmiştir. Dört farklı bağlayıcılar, süksinik ve glutarik anhidrid gibi adipik ve pimelik asit, iki ila beş karbonlu karboksilik asit bağlayıcılar oluşturmak için siklizasyonu gerçekleştirmek için kullanıldı. Siklizasyon mikrodalga enerjisi kullanılarak yapıldı ve son ayırma ve yan zincir koruma giderme adımları, mikrodalga enerjisi manuel olarak yapıldı. Otomatik bir mikro dalga sentezleyicisi kullanımı, ürün saflığı geliştirilmiş ürün verimini ve sentez süresini kısalttığını göstermiştir. Bu genel bir protokol, in vitro ve in vivo önemli moleküler mekanizmasının anlaşılması ve daha fazla insan hastalıklar için potansiyel ilaçların geliştirilmesi peptidleri kullanan diğer çalışmalar için uygulanabilir.

Protocol

1. Ekipman ve Reaktifler Hazırlık Hazırlama ekipmanları Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir davlumbaz içindeki tüm adımları uygulayın. Kimyasal olarak (a cam bir sır ile 30 ml), bir Teflon bir reaksiyon kabı içinde, mikrodalga güç iletimi kontrol etmek için bir fiber optik ısı algılayıcı ile teçhiz Discover bir ek modül ile bir mikrodalga Peptid Sentezleyicisi kullanılarak katı destek üzerinde veya tek polipropilen peptidleri sentezler Kartuş (kaba frit …

Representative Results

Burada özellikle Leishmania parazitinin hayati PPIs hedef ve (antiparaziter ajanlar 87 olarak PPIs hedef peptidler hakkında inceleme için) antiparaziter ajanlar gibi hareket omurga halkalı peptidler odaklanmış küçük bir kütüphane gelişimini açıklar. Yeni bir omurga siklik peptit sentezi yoluyla farmakoforlar, uzatılabilir büyüklükte bir iskele halinde muhafaza edilmektedir. Burada önerilen odaklanmış kütüphanenin gücü siklizasyonu yoluyla yapısal serbestlik kısıtlı bir de…

Discussion

Tam otomatik bir sentezleyici kullanılarak mikrodalga Layişmanya parazitin LACK proteini elde edilen omurgası, siklik peptitlerin odaklanmış bir kütüphane sentezi tarif edilmektedir. Siklik peptidlerin bir odaklanmış kütüphanesi korunmuş pharmacophores ve çeşitli bağlayıcılar ile geliştirilmiştir. Örneğin glutarik anhidrit, süksinik anhidrit, adipik asit, pimelik asit, lizin, ornitin, ve diğer yapı blokları gibi çeşitli bağlayıcıların eklenmesi siklik peptidlerin konformasyonal al…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yararlı tartışmalar için Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang ve Daria Mochly-Rosen teşekkür ederiz. Fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı NQ için çalışma Sağlık Hibe NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’- Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
Diisopropylcarbodiimide (DIC)
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Name  Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams™ nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochimie. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochimie. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O’Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using ‘safety catch’ methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based ‘building block’ approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O’Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis – A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Tags

Keywords: Backbone Cyclic Peptide LibraryAntiparasitic TherapeuticsMicrowave IrradiationProtein-protein InteractionsAmino AcidActivatorActivator BasePolypropylene CartridgeCoupling ReactionNN-dimethylformamidePiperidine1-hydroxybenzotriazoleDichloromethane1-methyl-2-pyrrolidinoneAnhydride4-DimethylaminopyridineNN-diisopropylethylamineTrifluoroacetic AcidTriisopropylsilane
check_url/fr/53589?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image