وضع العمود الفقري مكتبة الببتيد دوري كما المحتملة ضد الطفيليات التداوي عن طريق الميكروويف تشعيع
Summary
A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي المعنية عن كثب في جميع العمليات الحيوية تقريبا، وترتبط لكثير من الأمراض البشرية. ولذلك، هناك جهد كبير لاستهداف مثبطات مضخة البروتون في مجال البحوث الأساسية وصناعة الأدوية. واجهات البروتين البروتين عادة ما تكون كبيرة، شقة، وغالبا ما تفتقر إلى جيوب، تعقيد اكتشاف الجزيئات الصغيرة التي تستهدف هذه المواقع. نهج استهداف بديلة باستخدام أجسام مضادة لها قيود بسبب سوء التوافر الحيوي عن طريق الفم، وانخفاض الخلية النفاذية، وعدم كفاءة الإنتاج.
استخدام الببتيدات لاستهداف واجهات PPI ديها العديد من المزايا. الببتيدات لديها أعلى من المرونة بتكوين وزيادة الانتقائية، وعادة ما تكون غير مكلفة. ومع ذلك، الببتيدات لها حدودها الخاصة بما في ذلك سوء الاستقرار وعدم الكفاءة عبور أغشية الخلايا. للتغلب على هذه القيود، الببتيد cyclization لا يمكن أن يؤديها. وقد تجلى Cyclization لتحسين الببتيد الانتقائيةوالاستقرار الأيض، والتوافر البيولوجي. ومع ذلك، توقع التشكل النشطة بيولوجيا من الببتيد دوري ليست تافهة. للتغلب على هذا التحدي، واحدة نهج جذابة على الشاشة مكتبة مركزة على الشاشة فيه جميع الببتيدات الحلقية العمود الفقري لها تسلسل الأساسي نفسه، ولكنها تختلف في المعايير التي تؤثر على التشكل، مثل حجم الحلقة والموقف.
وصفنا بروتوكول مفصلة لتجميع مكتبة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون الطفيلي محددة. باستخدام نهج التصميم الرشيد، وضعنا الببتيدات المستمدة من البروتين سقالة L eishmania مستقبلات لتنشيط C-كيناز (قلة). افترضنا أن تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في homolog المضيف الثدييات، قد تمثل مواقع التفاعل البروتينات التي تعتبر بالغة الأهمية لبقاء الطفيليات. تم توليفها الببتيدات الحلقية باستخدام أشعة المايكروويف لتقليل زمن رد الفعل وزيادةكفاءة. تطوير مكتبة العمود الفقري الببتيدات الحلقية مع أحجام رنين مختلفة تسهل شاشة منهجية لالتشكل النشطة الأكثر البيولوجي. يوفر هذا الأسلوب بشكل عام، وبسرعة، والسطحية لتجميع الببتيدات الحلقية.
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) تلعب دورا محوريا في معظم العمليات الحيوية، من داخل الخلايا نقل الإشارة إلى خلية الموت 1. وبالتالي، تستهدف مثبطات مضخة البروتون هي ذات أهمية أساسية لالبحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. مثبطات مضخة البروتون يمكن تنظيمها من قبل الأجسام المضادة محددة ومستقرة، ولكن الأجسام المضادة هي مكلفة وصعبة لتصنيع ويعانون من ضعف التوافر البيولوجي. بدلا من ذلك، مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تكون مستهدفة من قبل الجزيئات الصغيرة. الجزيئات الصغيرة هي أسهل لتجميع وغير مكلفة بالمقارنة مع الأجسام المضادة. ومع ذلك، فهي نسبيا أقل مرونة وتناسب أفضل لتجاويف صغيرة بدلا من واجهات كبيرة من البروتين البروتين 2،3. وقد أثبتت الدراسات المتنوعة التي الببتيدات، والتي هي أبسط وأرخص من الأجسام المضادة وأكثر مرونة من جزيئات صغيرة، يمكن ربط واجهات البروتين وتنظيم مثبطات مضخة البروتون 4،5. وتقدر قيمة سوق الببتيد العلاجي العالمي حول 15000000000 دولار في عام 2013 وينمو 10.5٪ أنواLLY 6. وعلاوة على ذلك، هناك أكثر من 50 الببتيدات تسويقها، نحو 270 الببتيدات في مراحل مختلفة من الاختبارات السريرية، وحوالي 400 الببتيدات في مراحل ما قبل السريرية المتقدمة 7. على الرغم من أن العديد من الببتيدات تستخدم كأدوية، والببتيدات لا تزال تشكل العديد من التحديات التي تحد من تطبيق على نطاق واسع من بينها قلة التوافر البيولوجي والاستقرار، وعدم الكفاءة في أغشية الخلايا المعبر، والمرونة بتكوين 8،9. بديل واحد لتجاوز هذه العوائق هو تطبيق تعديلات مختلفة مثل المحلي (حمض أميني-D و N-الألكلة) والعالمي (cyclization) القيود 8،10-12. كما تحدث هذه التعديلات بشكل طبيعي. على سبيل المثال، السيكلوسبورين A، الببتيد الطبيعي دوري المناعة، ويحتوي على الأحماض الأمينية-D واحد ويخضع لتعديلات N-الألكلة 13،14.
تعديل الأحماض الأمينية الطبيعية للحث على القيود المحلية، مثل D- وN-الألكلة، وغالبا ما يؤثر على الببتيد9؛ ق النشاط البيولوجي. ومع ذلك، cyclization، التي تتابع الفائدة يمكن أن يبقى كما هو، هو أكثر عرضة للحفاظ على النشاط البيولوجي. Cyclization هو وسيلة جذابة للغاية لتقييد مساحة بتكوين الببتيد عن طريق الحد من التوازن بين التشكل مختلفة. فإنه عادة ما يزيد من النشاط البيولوجي والانتقائية من خلال الحد من الببتيد إلى التشكل النشط الذي يتوسط وظيفة واحدة فقط. Cyclization أيضا يحسن الاستقرار الببتيد عن طريق الحفاظ على الببتيد في التشكل الذي أقل معترف بها من قبل الانزيمات المهينة. في الواقع، عرضت الببتيدات الحلقية قد تحسنت الاستقرار الأيض، التوافر البيولوجي، والانتقائية مقارنة مع نظرائهم الخطية 15-17.
ومع ذلك، يمكن cyclization أن يكون سلاح ذو حدين لأنه في بعض الحالات قد يمنع تقييد الببتيدات من تحقيق التشكل النشطة بيولوجيا. للتغلب على هذه العقبة، مكتبة مركزة فيه جميع الببتيدات لديها نفس sequenc الأوليةيمكن توليفها الإلكترونية وبالتالي ثابتة pharmacophores. الببتيدات في المكتبة تختلف في المعايير التي تؤثر على هيكلها، مثل حجم الحلبة، والموقف، وذلك لفحص في وقت لاحق لالتشكل الأكثر النشطة بيولوجيا 9،18.
الببتيدات يمكن توليفها في كل حل ونهج التوليف الببتيد الحالة الصلبة (SPPS)، والتي هي الآن نهج التوليف الببتيد أكثر انتشارا وسيجري بحثه باستفاضة. SPPS هو العملية التي تتم التحولات الكيميائية على دعم قوي من خلال رابط لإعداد مجموعة واسعة من المركبات الاصطناعية 19. SPPS يتيح تجميع الببتيدات بواسطة اقتران التوالي من الأحماض الأمينية بطريقة متدرجة من C-المحطة، التي يتم تركيبها على دعم قوي، إلى N-المحطة. يجب أن ملثمين الحامض الجانب سلاسل N-α-الأمينية مع حماية الفئات التي هي مستقرة في ظروف التفاعل استخدمت خلال الببتيد استطالة لضمان إضافة حمض أميني واحد في كل شارعالجيش الشعبي. في الخطوة النهائية، يتم تحرير الببتيد من الراتنج والجانب سلسلة حماية الفئات تتم إزالة متزامنة. في الوقت الذي يجري تصنيعه الببتيد، يمكن إزالة جميع الكواشف القابلة للذوبان من الدعم مصفوفة الببتيد الصلبة عن طريق الترشيح وجرفت في نهاية كل خطوة اقتران. مع مثل هذا النظام، وفائض كبير من المواد الكيميائية في تركيز عال يمكن أن تدفع ردود الفعل اقتران على الانتهاء وجميع الخطوات التوليف لا يمكن أن يؤديها في السفينة نفسها دون أي نقل للمواد 20.
على الرغم من SPPS بعض القيود مثل إنتاج ردود فعل غير مكتملة، التفاعلات الجانبية، الكواشف النجسة، فضلا عن الصعوبات رصد رد فعل 21، جعلت من "المعيار الذهبي" لتخليق الببتيد مزايا SPPS. وتشمل هذه المزايا خيار دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية، والأتمتة، وتنقية سهلة، والخسائر المادية مصغر، واستخدام الكواشف الزائدة، مما أدى إلىعوائد عالية. وقد تبين SPPS أن تكون مفيدة للغاية في تركيب سلاسل صعبة 21،22، التعديلات الفلورسنت 23، والمكتبات الببتيد 24،25. SPPS هو أيضا مفيد جدا لغيرها من التجمعات بولي سلسلة مثل [أليغنوكليوتيد 26،27، 28،29 يغوساكاريدس، والببتيد الأحماض النووية 30،31. ومن المثير للاهتمام، في بعض الحالات، تبين SPPS ليكون من المفيد لتجميع الجزيئات الصغيرة التي تتم عادة في حل 32،33. يستخدم SPPS سواء في نطاق ضيق للبحث والتدريس 34،35 وكذلك على نطاق واسع في صناعة 36-38.
استراتيجيات تركيب اثنين من التي تستخدم بشكل رئيسي في منهجية SPPS لتركيب الببتيدات هي butyloxycarbonyl (بوك) و 9 fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). كانت الاستراتيجية الأصلية قدم لSPPS بوك، الأمر الذي يتطلب شروط حمض قوية لإزالة جانب سلسلة حماية الفئات ويلتصق الببتيد من صESIN. التوليف الببتيد تستند Fmoc، ومع ذلك، يستخدم الظروف قاعدة المعتدلة ويعتبر بديل أكثر اعتدالا لحمض عطوب بروتوكول بوك 39. استراتيجية Fmoc تستخدم المتعامدة تي بوتيل (TBU) حماية جانبية السلسلة التي تم إزالتها في الخطوة الأخيرة من التوليف بينما الشق الببتيد من راتنج تحت الظروف الحمضية.
ويرد المبدأ العام لتخليق الببتيد على دعم قوي في الشكل 1. والأحماض الأمينية الأولي، من قبل ملثمين مجموعة حماية مؤقتة على N-α-المحطة، يتم تحميل على الراتنج من C-المحطة. ويستخدم فريق حماية شبه دائمة لإخفاء سلسلة الجانب أيضا إذا لزم الأمر (الشكل 1، الخطوة 1). يتم تجميع توليف الببتيد الهدف من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية N-α-مؤقتة (الشكل 1، الخطوة 2) واقتران المقبل الأحماض الأمينية المحمية (الشكل 1 </str أونج> الخطوة 3). بعد تحميل الماضي الأحماض الأمينية (الشكل 1، الخطوة 4)، هو المشقوق الببتيد من الدعم الراتنج وطرد الجماعات حماية شبه دائمة (الشكل 1، الخطوة 5).
الشكل 1. مخطط عام للنفايات الصلبة الببتيد مرحلة التوليف. ويرتكز هذا الحمض الأميني N-α محمية باستخدام مجموعة الكربوكسيل عن طريق رابط لالراتنج (الخطوة 1). يتم تجميعها الببتيد المطلوب بطريقة خطية من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية مؤقتة (TPG) من N-α (الخطوة 2) واقتران الأحماض الأمينية (الخطوة 3). بعد إنجاز عملية التوليف (الخطوة 4)، وdeprotected المجموعات حماية شبه دائمة (SPG) أثناء الانقسام الببتيد (الخطوة 5).الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد تجميع سلسلة الببتيد كاملة، لا يمكن أن يتحقق cyclization عدة بدائل: (A) وجها لالذيل cyclization – وهذا هو وسيلة مريحة ولكن محدودة لأنها توفر خيار واحد فقط لcyclization (الشكل 2A)، (B) cyclization باستخدام الأحماض الأمينية من سلسلة من الفائدة التي تحتوي على المجموعات الوظيفية النشطة بيولوجيا – ومع ذلك، فإن استخدام هذه الأحماض الأمينية قد تؤثر على النشاط البيولوجي (الشكل 2B)، و (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية (أو اللبنات الأخرى) من دون إزعاج تسلسل النشطة بيولوجيا. إدخال هذه الجزيئات هي على نطاق واسع لأنه يتيح إنتاج المكتبات تركز دون تعديل تسلسل الفائدة (الشكل 2C).
Figure 2. استراتيجيات cyclization الببتيد البديل (A) الرأس الى الذيل cyclization، من خلال السندات الببتيد بين C-محطة وN-محطة؛ (B) cyclization بين المجموعات الوظيفية مثل السندات ثاني كبريتيد بين السيستين المخلفات (1)، أو سندات أميد بين السلاسل الجانبية من ليسين لالأسبارتيك / حمض الجلوتاميك (2)، أو سلسلة جانبية لN- أو C-محطة (3 -4)؛ (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية إضافية أو مشتقات الأحماض الأمينية أو الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال قبل (R0) وبعد (R7) تسلسل النشطة بيولوجيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يستخدم توليف أشعة الميكروويف لتسخين ردود الفعل، وبالتالي تسريع الكيميائية العضوية التي يساعدها الميكروويف التحولات 40،41. ويستند كيمياء الموجات الصغيرة على قدرة كاشف / مذيب لاستيعابالميكروويف الطاقة وتحويله إلى حرارة 42. قبل أن تصبح هذه التكنولوجيا على نطاق واسع، وكان من العوائق الرئيسية التي يجب التغلب عليها، بما في ذلك التحكم واستنساخ بروتوكولات التوليف وعدم وجود نظم المتاحة لدرجة الحرارة والضغط ضوابط كافية 43،44. وقد تم التقرير الأول من التوليف الببتيد بمساعدة الميكروويف باستخدام الميكروويف المطبخ لتجميع عدة الببتيدات قصيرة (7-10 الأحماض الأمينية) مع تحسن ملحوظ في كفاءة اقتران ونقاء 45. وعلاوة على ذلك، وقد تبين طاقة الميكروويف إلى تقليل سلسلة التجميع، والحد من التفاعلات الجانبية، والحد من تروسم، وتحسين معدلات اقتران، وكلها حيوية لتسلسل صعبة وطويلة 46-53.
حاليا استخدام الإشعاع الميكروويف لتركيب الببتيدات أو المركبات ذات الصلة على دعم قوي واسعة النطاق، بما في ذلك (A) التوليف في الماء بدلا من المذيبات العضوية 54؛ (B) توليف الببتيدات معالتعديلات بعد متعدية المشتركة، مثل glycopeptides 55-58 أو 59-61 phosphopeptides، الذي التوليف يصعب عادة بسبب كفاءة اقتران منخفضة من إعاقة sterically مشتقات الأحماض الأمينية. (C) توليف الببتيد مع تعديل في العمود الفقري، مثل azapeptides، والتي يمكن أن يشكلها استبدال C (α) من بقايا الأحماض الأمينية مع ذرة النيتروجين 62، أو peptoids، التي يتم توصيلها إلى سلسلة جانبية النيتروجين أميد بدلا من الذرة Cα 63،64. (D) التوليف من الببتيدات الحلقية 65-71. و (E) توليف المكتبات اندماجي 51،72. وفي العديد من الحالات، ذكرت والكتاب كفاءة أعلى وتخفيض الوقت التوليف باستخدام أشعة الميكروويف بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي.
باستخدام تصميم عقلاني 73-75، وضعنا الببتيدات المضادة للالطفيلية التي كانت مستمدة من مستقبلات السقالة L eishmania في FOص تنشيط C-كيناز (قلة). LACK تلعب دورا هاما في المرحلة المبكرة من العدوى الليشمانيا 76. الطفيليات معربا عن مستويات أدنى نقص تفشل في تتطفل حتى الفئران خطر المناعية 77 كما تشارك نقص في عمليات الطفيلي يشير الأساسية وتخليق البروتين 78. لذلك، وعدم هو بروتين سقالة الرئيسي 79 وهدف المخدرات قيمة. التركيز على تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في البلد المضيف الثدييات homolog RACK، حددنا من الأحماض الأمينية الببتيد 8 (RNGQCQRK) إنخفاضا الليشمانيا ليرة سورية. الجدوى في الثقافة.
هنا، نحن تصف بروتوكول لتركيب العمود الفقري دوري الببتيدات المستمدة من تسلسل البروتين LACK المذكورة أعلاه. تم توليفها الببتيدات على دعم قوي باستخدام الميكروويف التدفئة عن طريق منهجية SPPS مع بروتوكول Fmoc / TBU. تم مترافق الببتيدات إلى TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) الناقل الببتيد من خلال السندات أميد كماجزء من SPPS. وقد استخدم النقل استنادا TAT من مجموعة متنوعة من البضائع إلى داخل الخلايا لأكثر من 15 عاما، وقد تم تأكيد تسليم البضائع إلى العضيات التحت خلوية 80. أربعة linkers مختلفة، السكسينيك وأنهيدريد الغلوتاريك وكذلك الأديبيك وحمض البيميليك، استخدمت لأداء cyclization لتوليد linkers حمض الكربوكسيلية من 2-5 الكربون. وقد تم Cyclization باستخدام طاقة الميكروويف، وأجريت الانقسام وجنبا إلى سلسلة خطوات deprotection النهائية يدويا بدون طاقة الميكروويف. استخدام المزج الميكروويف الآلي تحسين نقاء المنتج، وزيادة المحصول المنتج، وتخفيض مدة التوليف. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول العام للدراسات الأخرى التي تستخدم الببتيدات لفهم الآلية الجزيئية مهمة في المختبر والمجراة وتطوير العقاقير المحتملة لعلاج أمراض الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوصف تركيب مكتبة مركزة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية المستمدة من البروتين عدم وجود طفيل الليشمانيا في استخدام المزج الميكروويف مؤتمتة بالكامل. وقد وضعت مكتبة مركزة من الببتيدات الحلقية مع pharmacophores التمايز ومختلف linkers. إضافة linkers مختلفة مثل أنهيدريد الغلوت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لورين فان فاسينهوف، Sunhee هوانج، وداريا Mochly روزين لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH منح RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) لكيو زيارتها للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| REAGENTS | |||
| Solid support, Rink Amide AM resin ML | CBL | BR-1330 | loading: 0.49 mmol/g |
| Fmoc-Ala-OH | Advanced Chemtech | FA2100 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Advanced Chemtech | FR2136 | |
| Fmoc-Asn(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FN2152 | |
| Fmoc-Asp(OBut)-OH | Advanced Chemtech | FD2192 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FC2214 | |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FQ2251 | |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Advanced Chemtech | FE2237 | |
| Fmoc-Gly-OH | Advanced Chemtech | FG2275 | |
| Fmoc-His(Trt)-OH | Advanced Chemtech | FH2316 | |
| Fmoc-Ile-OH | Advanced Chemtech | FI2326 | |
| Fmoc-Leu-OH | Advanced Chemtech | FL2350 | |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FK2390 | |
| Fmoc-Met-OH | Advanced Chemtech | FM2400 | |
| Fmoc-Phe-OH | Advanced Chemtech | FF2425 | |
| Fmoc-Pro-OH | Advanced Chemtech | FP2450 | |
| Fmoc-Ser-(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FS2476 | |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | Advanced Chemtech | FT2518 | |
| Fmoc-Trp(Boc)-OH | Advanced Chemtech | FW2527 | |
| Fmoc-Tyr(But)-OH | Advanced Chemtech | FY2563 | |
| Fmoc-Val-OH | Advanced Chemtech | FV2575 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma | 328634 | Caution Toxic/Highly flammable/Irritant. |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Alfa Aesar | 43465 | Caution Toxic |
| Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition. | |||
| Dichloromethane (DCM) | Sigma | D65100 | Caution Harmful |
| Dibromomethane (DBM) | Sigma | D41868 | Caution Harmful |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | T62200 | Caution Corrosive/Toxic |
| Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) | Sigma | 91707 | Caution Corrosive/Toxic |
| Diethylether | Sigma | 31690 | Caution Highly flammable/Harmful |
| Triisopropylsilane (TIS) | Sigma | 233781 | Caution Irritant/Flammable |
| Water, HPLC grade | Sigma | 270733 | |
| Acetonitroile, HPLC grade (ACN) | Fisher Scientific | A998-4 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
| N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) | Sigma | 3440 | Caution Corrosive/Highly flammable |
| Piperidine | Sigma | W290807 | Caution Toxic/Highly flammable |
| Pyridine | Sigma | 270970 | Caution Highly flammable/Harmful |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | 459844 | Caution Highly flammable/Irritant |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) | Sigma | 157260 | Caution Highly flammable/Irritant/Harmful |
| O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Sigma | 12804 | Caution Irritant/Harmful |
| Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) | Advanced Chemtech | RC8602 | Caution Irritant |
| Ninhydrin | Sigma | 454044 | Caution Harmful |
| Phenol | Sigma | P3653 | Caution Corrosive/Toxic |
| Potassium cyanide (KCN) | Sigma | 11813 | Caution Very Toxic |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma | 221473 | Caution Toxic |
| N,N’- | Sigma | 38370 | Caution Flammable/ Toxic |
| Diisopropylcarbodiimide (DIC) | |||
| 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma | 522805 | Caution Toxic/Irritant |
| Glutaric anhydride | Sigma | G3806 | Caution Flammable/Irritant/Harmful |
| Succinic anhydride | Sigma | 239690 | Caution Irritant/Harmful |
| Adipic acid | Sigma | A26357 | Caution Toxic/Irritant |
| Pimelic acid | Sigma | P45001 | Caution Toxic/Irritant |
| Chloranil | Sigma | 23290 | Caution Toxic/Irritant |
| Acetaldehyde | Sigma | 402788 | Caution Flammable/ Toxic |
| EQUIPMENT | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R centrifuge | |
| Lyophilizer | Labconco | freezone 4.5 | |
| Vacuum pump | Franklin Electric | model 1101101416 with 3/4 HP | Alcatel pump with Franklin Motor |
| Polypropylene cartridge 12 ml | Applied Separation | 2419 | |
| Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8157 | |
| Polypropylene cartridge 3 ml | Applied Separation | 2413 | |
| Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge | Applied Separation | 8054 | |
| Stop cocks PTFE | Applied Separation | 2406 | |
| Tubes flat, 50 ml | VWR | 21008-240 | |
| Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes | Waters | WAT200609 | |
| Shaker, BD adams™ nutator mixer | Fisher scientific | 22363152 | |
| Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml | Fisher scientific | 03-312-8 | |
| Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB-501, 500 ml | |
| Heating block | Thermolyne | 1760 dri bath | |
| Disposable borosilicate glass tubes with plain end | Fisher Scientific | 14-961-25 | |
| Micropipettes and tips Finnpipette | Thermo | 20–200 and 100–1,000 μl | |
| HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100 | VWR | 69400-124 | |
| HPLC vial- Blue Snap-It Cap | VWR | 66030-600 | |
| Analytical HPLC column | Peeke Scientific | U1-5C18Q-JJ | ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm |
| Prep HPLC column, XBridge | Waters | OBD C18 5 µm column | 19 mm × 150 mm |
| Mass spectrometer | Applied Biosystems | Voyager DE-RP |
References
- Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
- Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
- Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochimie. 37 (16), 5616-5622 (1998).
- Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
- Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
- Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, 17-24 (2005).
- Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
- Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
- Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
- Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
- Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochimie. 30 (26), 6574-6583 (1991).
- Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
- Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O’Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
- Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
- Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
- Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using ‘safety catch’ methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
- Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
- Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
- Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based ‘building block’ approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
- Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
- Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
- Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
- Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
- Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
- Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
- Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
- O’Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
- Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
- Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
- Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis – A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
- Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
- Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
- Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
- Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
- Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
- Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
- Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
- de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
- Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
- Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
- Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
- Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
- Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
- Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
- Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
- Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
- Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
- Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
- Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
- Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
- Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
- Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
- Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
- Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
- Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
- Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
- Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
- Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
- Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
- Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
- Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
- Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
- Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
- Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
- Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
- Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
- Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
- Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
- Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
- Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
- Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710 (2011).
- Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
- Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
- Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
- Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
- Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
- Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
- Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
- Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
- King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
- Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
- Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
- Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
- Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).
