Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

Summary

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Abstract

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono intimamente coinvolti in quasi tutti i processi biologici e sono collegati a molte malattie umane. Pertanto, vi è un grande sforzo per PPI nella ricerca di base e del settore farmaceutico bersaglio. Interfacce proteina-proteina sono di solito grandi, piatti, e spesso non hanno le tasche, complicando la scoperta di piccole molecole che hanno come target tali siti. Approcci di targeting alternativi utilizzando anticorpi hanno delle limitazioni dovute alla scarsa biodisponibilità orale, a bassa permeabilità cellulare, e inefficienza della produzione.

Utilizzo di peptidi per indirizzare le interfacce PPI ha diversi vantaggi. Peptidi hanno una maggiore flessibilità conformazionale, una maggiore selettività, e sono generalmente poco costoso. Tuttavia, i peptidi hanno i loro limiti, tra cui scarsa stabilità e inefficienza attraversare le membrane cellulari. Per superare tali limitazioni, peptide ciclizzazione può essere eseguita. Ciclizzazione ha dimostrato di migliorare la selettività peptide, Stabilità metabolica e biodisponibilità. Tuttavia, prevedere la conformazione bioattiva di un peptide ciclico non è banale. Per superare questa sfida, un attraente approccio a schermo una libreria mirato per schermo in cui tutti i peptidi ciclici backbone hanno la stessa sequenza primaria, ma si differenziano per i parametri che influenzano la loro conformazione, come la dimensione e la posizione dell'anello.

Descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi di una libreria di backbone peptidi ciclici mirati specifici PPI parassita. Utilizzando un approccio progettuale razionale, abbiamo sviluppato peptidi derivati ​​dalla proteina patibolo recettore L eishmania per C attivata-chinasi (mancanza). Abbiamo ipotizzato che le sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel omologo mammifero ospite, possono rappresentare siti di interazione per le proteine ​​che sono fondamentali per la vitalità dei parassiti. I peptidi ciclici sono stati sintetizzati utilizzando irradiazione a microonde per ridurre i tempi di reazione e aumentareefficienza. Lo sviluppo di una libreria di backbone peptidi ciclici con misure degli anelli diversi facilita una schermata sistematica per la conformazione attiva più biologica. Questo metodo fornisce un modo generale, veloce e facile da sintetizzare peptidi ciclici.

Introduction

Interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nella maggior parte dei processi biologici, da intracellulare trasduzione del segnale di morte cellulare ^1. Quindi, il targeting PPI è di fondamentale importanza per la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. PPI possono essere regolate da anticorpi specifici e stabili, ma anticorpi sono costosi e difficili da produrre e hanno scarsa biodisponibilità. In alternativa, PPI possono essere bersaglio di piccole molecole. Piccole molecole sono più facili da sintetizzare e poco costoso rispetto agli anticorpi; tuttavia, sono relativamente meno flessibili e si adattano meglio piccole cavità di grandi interfacce proteina-proteina ^2,3. Diversi studi hanno dimostrato che i peptidi, che sono più semplici e meno costosi rispetto agli anticorpi e più flessibile di piccole molecole, possono legarsi interfacce proteine ​​e regolare PPI ^4,5. Il mercato globale peptide terapeutico è stata valutata una quindicina di miliardi di dollari nel 2013 ed è in crescita del 10,5% annually ^6. Inoltre, ci sono più di 50 peptidi commercializzati, circa 270 peptidi in diverse fasi di sperimentazione clinica, e circa 400 peptidi in fase preclinica avanzate ^7. Sebbene numerosi peptidi vengono utilizzati come farmaci, peptidi pongono ancora diverse sfide che limitano la loro applicazione diffusa tra cui scarsa biodisponibilità e la stabilità, l'inefficienza nelle membrane cellulari di attraversamento, e la flessibilità conformazionale ^8,9. Una alternativa per superare questi inconvenienti è applicare diverse modifiche come (D-amminoacido e N-alchilazione) locale e globale (ciclizzazione) vincoli ^8,10-12. Queste modifiche si verificano anche in natura. Ad esempio, ciclosporina A, un peptide ciclico naturale immunosoppressore, contiene un singolo D-amminoacido e subisce N-alchilazione modifiche ^13,14.

Modifica di aminoacidi naturali per indurre vincoli locali, come D- e N-alchilazione, spesso colpisce il peptide9; s attività biologica. Tuttavia, ciclizzazione, in cui la sequenza di interesse può rimanere lo stesso, è più probabile per preservare l'attività biologica. Ciclizzazione è un modo molto attraente per restringere peptide spazio conformazionale riducendo l'equilibrio tra le diverse conformazioni. Di solito aumenta l'attività biologica e selettività limitando il peptide alla conformazione attiva che media una sola funzione. Ciclizzazione migliora anche la stabilità peptide mantenendo il peptide in una conformazione che è meno riconosciuto da enzimi di degradazione. Infatti, peptidi ciclici hanno dimostrato di aver migliorato la stabilità metabolica, la biodisponibilità, e la selettività rispetto ai loro omologhi lineari ^15-17.

Tuttavia, ciclizzazione può essere un'arma a doppio taglio poiché in alcuni casi la restrizione può impedire che i peptidi di raggiungere una conformazione bioattiva. Per superare questo ostacolo, una biblioteca focalizzato in cui tutti i peptidi hanno lo stesso SEQUENC primarioe di conseguenza costanti pharmacophores possono essere sintetizzati. Peptidi nella libreria differiscono parametri che influenzano la loro struttura, come la dimensione e la posizione dell'anello, in modo da schermare successivamente per la conformazione più bioattivo ^9,18.

I peptidi possono essere sintetizzati sia in soluzione e da un approccio di sintesi peptidica in fase solida (SPPS), che ora è il metodo più diffuso sintesi peptidica e sarà discusso ulteriormente. SPPS è un processo mediante il quale trasformazioni chimiche vengono eseguite su un supporto solido tramite un linker per preparare una vasta gamma di composti sintetici ^19. SPPS consente assemblaggio peptidi di accoppiamento consecutivo di aminoacidi in modo graduale dal C-terminale, che è attaccato ad un supporto solido, al N-terminale. Le catene laterali di acido N-alfa-ammino devono essere mascherati con gruppi protettivi che sono stabili nelle condizioni di reazione utilizzate durante peptide allungamento per garantire l'aggiunta di un amminoacido per step. Nella fase finale, il peptide viene rilasciato dalla resina e la catena laterale gruppi protettori sono contemporaneamente rimossi. Mentre il peptide viene sintetizzato, tutti i reagenti solubili possono essere rimossi dal peptide-solido matrice di supporto per filtrazione e lavato via alla fine di ogni fase di accoppiamento. Con tale sistema, un grande eccesso di reagenti ad alta concentrazione può guidare reazioni di accoppiamento a completamento e tutti i passaggi di sintesi può essere effettuato nello stesso recipiente senza trasferimento di materiale ^20.

Sebbene SPPS ha alcune limitazioni, quali la produzione di reazioni incomplete, reazioni collaterali, reagenti impuri, nonché difficoltà di controllo della reazione ^21, i vantaggi di SPPS hanno reso il "gold standard" per la sintesi peptidica. Questi vantaggi includono la possibilità di incorporare amminoacidi non naturali, automazione, facile purificazione, perdite fisiche minimizzate, e l'uso di reagenti in eccesso, con conseguentealti rendimenti. SPPS ha dimostrato di essere estremamente utile nella sintesi di sequenze difficili ^21,22, modifiche fluorescenti ^23, e librerie peptidiche ^24,25. SPPS è anche molto utile per altri assembly poli-chain, come oligonucleotidi ^{26,27, 28,29,} oligosaccaridi e peptide acidi nucleici ^30,31. È interessante notare che, in alcuni casi, SPPS ha dimostrato di essere vantaggioso per sintetizzare piccole molecole che sono tradizionalmente realizzati in soluzione ^32,33. SFF è utilizzato sia in piccola scala per la ricerca e l'insegnamento ^34,35, così come su larga scala nel settore industriale ^36-38.

Due strategie di sintesi che sono utilizzati principalmente nella metodologia SPPS per la sintesi di peptidi sono butilossicarbonile (Boc) e 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La strategia originale introdotte per SPPS era Boc, che richiede condizioni di acidi forti per rimuovere catena laterale gruppi protettori e fendere il peptide dal rEsin. Sintesi peptidica Fmoc-based utilizza tuttavia moderate condizioni di base ed è un mite alternativa al protocollo Boc acido labile ^39. La strategia Fmoc utilizza ortogonale t-butile (tBu) Protezione catena laterale che viene rimosso nell'ultimo passaggio della sintesi mentre fende il peptide dalla resina in condizioni acide.

Il principio generale per la sintesi peptidica su supporto solido è presentato de Figura 1. L'aminoacido iniziale, mascherato da un gruppo di protezione temporanea sul N-α-terminale, viene caricato sulla resina dal C-terminale. Un gruppo protettivo semipermanente per mascherare la catena laterale è anche utilizzato se necessario (Figura 1, Passaggio 1). La sintesi del peptide bersaglio viene assemblato dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo N-α-temporaneo (Figura 1, fase 2) e accoppiamento del successivo amminoacido protetto (Figura 1 </str ong>, punto 3). Dopo l'ultimo aminoacido viene caricato (Figura 1, fase 4), il peptide viene scissa dal supporto di resina e dei gruppi protettivi semi-permanenti sono rimossi (Figura 1, fase 5).

Figura 1. Schema generale di sintesi in fase solida del peptide. L'amminoacido N-α-protetto viene ancorato con il gruppo carbossilico tramite un linker alla resina (Passaggio 1). Il peptide desiderato viene assemblata in modo lineare dal C-terminale all'N-terminale da cicli ripetitivi di deprotezione del gruppo protettivo temporaneo (TPG) dal N-α (Fase 2) e accoppiamento aminoacido (Passaggio 3). Dopo realizzare la sintesi (passo 4), i gruppi protettori semipermanenti (SPG) sono deprotetto durante peptide clivaggio (Fase 5).ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo il montaggio della catena peptidica completa, ciclizzazione può essere ottenuto mediante diverse alternative: (A) testa-coda ciclizzazione – questo è un modo conveniente ma limitato in quanto fornisce una sola opzione per ciclizzazione (Figura 2A), (B) ciclizzazione utilizzando gli aminoacidi della sequenza di interesse che contengono gruppi funzionali bioattive – tuttavia, l'uso di questi aminoacidi può influenzare l'attività biologica (Figura 2B), e (C) ciclizzazione aggiungendo aminoacidi (o altri blocchi) senza disturbare la sequenza bioattivo. Introducendo queste molecole è diffuso in quanto consente produzione di librerie focalizzate senza modificare la sequenza di interesse (Figura 2C).

FIGURA 2. strategie peptide Alternativa ciclizzazione (A) testa-coda ciclizzazione, attraverso un legame peptidico tra il C-terminale e N-terminale.; (B) ciclizzazione tra i gruppi funzionali come un legame disolfuro tra i residui di cisteina (1), o un legame ammidico tra le catene laterali di lisina per acido aspartico / glutammico (2), o catena laterale di N- o C-terminale (3 -4); (C) ciclizzazione con l'aggiunta di amminoacidi extra o derivati ​​degli aminoacidi o piccole molecole, ad esempio prima (R0) e dopo (R7) la sequenza bioattivo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Micro-onde sintesi utilizza irradiazione a microonde per riscaldare le reazioni, accelerando così chimico organico trasformazioni ^40,41. Microonde chimica è basata sulla capacità del reagente / solvente per assorbire ilforno a microonde di energia e convertirla in calore ^42. Prima che la tecnologia è diventata diffusa, grossi inconvenienti dovuti superare, compresa la controllabilità e la riproducibilità dei protocolli di sintesi e la mancanza di sistemi disponibili temperatura e di pressione adeguati controlli ^43,44. La prima relazione di micro-onde sintesi peptidica è stato fatto utilizzando un forno a microonde cucina per sintetizzare diversi peptidi brevi (7-10 aminoacidi), con un significativo miglioramento della efficienza di accoppiamento e la purezza ^45. Inoltre, l'energia a microonde ha dimostrato di diminuire aggregazione catena, ridurre le reazioni collaterali, limitare racemizzazione, e migliorare i tassi di accoppiamento, che sono tutti critici per difficili e lunghe sequenze ^46-53.

Attualmente l'uso di irradiazione con microonde per la sintesi di peptidi o composti correlati su un supporto solido è ampia, tra cui (a) Sintesi di acqua invece di solvente organico ^54; (B) sintesi di peptidi concomuni modificazioni post-traduzionali, come glicopeptidi ^55-58 o ^59-61 phosphopeptides, la cui sintesi è tipicamente difficile a causa della bassa efficienza di accoppiamento di derivati ​​amminoacidici stericamente impediti; (C) sintesi di peptidi con modifica del backbone, come azapeptides, che possono essere costituiti dalla sostituzione del C (α) di un residuo amminoacidico con un atomo di azoto ^62, o peptoids, la cui catena laterale è collegato al azoto ammidico piuttosto che l'atomo Cα ^63,64; (D) sintesi di peptidi ciclici ^65-71; e (E) sintesi di librerie combinatoriali ^51,72. In molti casi, gli autori hanno riportato una maggiore efficienza e ridotto tempo di sintesi usando irradiazione a microonde rispetto al protocollo convenzionale.

Utilizzando un design razionale ^73-75, abbiamo sviluppato peptidi anti-parassiti che sono stati ottenuti da recettore L del eishmania ponteggio FOattivato r C-chinasi (mancanza). MANCANZA svolge un ruolo importante nella fase precoce dell'infezione Leishmania ^76. Parassiti che esprimono bassi livelli di MANCANZA riescono a parassitare anche topi immunocompromessi ⁷⁷ la mancanza è coinvolta nei processi parassita segnalazione essenziali e sintesi proteica ^78. Pertanto, MANCANZA è una proteina impalcatura chiave ^{79 e} un altro obiettivo prezioso. Concentrarsi sulle sequenze in MANCANZA che si conservano nei parassiti, ma non nel mammifero ospite omologo RACK, abbiamo identificato un peptide 8 aminoacidi (RNGQCQRK) che è diminuita di Leishmania sp. Vitalità nella cultura.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di peptidi ciclici backbone derivati ​​dalla sequenza proteica LACK sopra descritta. I peptidi sono stati sintetizzati su un supporto solido mediante riscaldamento a microonde dalla metodologia SPPS con protocollo Fmoc / tBu. I peptidi sono stati coniugati ad un TAT _47-57 (YGRKKRRQRRR) carrier peptidico attraverso un legame ammidico comeparte del SPPS. Trasporti con sede a TAT di una varietà di carichi nelle cellule è stato utilizzato da oltre 15 anni e la consegna della merce in organuli subcellulari è stato confermato ^80. Quattro differenti linker, succinico e anidride glutarica nonché adipico e acido pimelico, sono stati usati per eseguire la ciclizzazione di generare linkers acidi carbossilici da due a cinque atomi di carbonio. Ciclizzazione è stato fatto utilizzando l'energia a microonde, e la scissione e della catena laterale fasi finali deprotezione sono stati fatti a mano, senza l'energia a microonde. L'uso di un sintetizzatore automatizzato microonde migliorato la purezza del prodotto, aumentato la resa del prodotto, e ha ridotto la durata della sintesi. Questo protocollo generale può essere applicato ad altri studi che utilizzano peptidi comprendere importante meccanismo molecolare in vitro e in vivo e sviluppare ulteriormente potenziali farmaci per malattie umane.

Protocol

1. Attrezzature e reagenti Preparazione Attrezzature Preparazione Eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa aspirante con un equipaggiamento di protezione personale. Chimicamente sintetizzare peptidi su supporto solido con un microonde Peptide Synthesizer con un modulo aggiuntivo di Discover dotato di una sonda di temperatura a fibre ottiche per il controllo della erogazione microonde alimentazione in un recipiente di reazione Teflon (30 ml, con una fritta di vetro) o in polipr…

Representative Results

Qui si descrive lo sviluppo di una piccola biblioteca mirata di backbone peptidi ciclici che colpiscono specificamente PPI vitali del parassita Leishmania e agiscono come agenti antiparassitari (per opinione su peptidi che colpiscono PPI come agenti antiparassitari 87). Attraverso la sintesi di nuovi backbone peptidi ciclici, farmacofori sono conservati in un ponteggio di dimensioni estensibile. La forza della biblioteca focalizzato qui proposto è la possibilità di variare le dimensioni peptide imp…

Discussion

La sintesi di una libreria mirata di backbone peptidi ciclici derivati ​​dalla proteina LACK del parassita Leishmania usando un forno a microonde sintetizzatore automatizzato è descritto. Una libreria concentrato di peptidi ciclici è stato sviluppato con farmacofori conservate e diversi linker. L'aggiunta di vari linker come anidride glutarica, anidride succinica, acido adipico, acido pimelico, lisina, ornitina, e altri blocchi può essere utilizzato per aumentare la varietà dello spazio conformazion…

Materials

REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML	CBL	BR-1330	loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma	328634	Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Alfa Aesar	43465	Caution Toxic
			Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM)	Sigma	D65100	Caution Harmful
Dibromomethane (DBM)	Sigma	D41868	Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma	T62200	Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA)	Sigma	91707	Caution Corrosive/Toxic
Diethylether	Sigma	31690	Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS)	Sigma	233781	Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade	Sigma	270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA)	Sigma	3440	Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine	Sigma	W290807	Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine	Sigma	270970	Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH)	Sigma	459844	Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)	Sigma	157260	Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)	Sigma	12804	Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP)	Advanced Chemtech	RC8602	Caution Irritant
Ninhydrin	Sigma	454044	Caution Harmful
Phenol	Sigma	P3653	Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN)	Sigma	11813	Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	221473	Caution Toxic
N,N’-	Sigma	38370	Caution Flammable/ Toxic
Diisopropylcarbodiimide (DIC)
4-Dimethylaminopyridine (DMAP)	Sigma	522805	Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride	Sigma	G3806	Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride	Sigma	239690	Caution Irritant/Harmful
Adipic acid	Sigma	A26357	Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid	Sigma	P45001	Caution Toxic/Irritant
Chloranil	Sigma	23290	Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde	Sigma	402788	Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer	Labconco	freezone 4.5
Vacuum pump	Franklin Electric	model 1101101416 with 3/4 HP	Alcatel pump with Franklin Motor
Polypropylene cartridge 12 ml	Applied Separation	2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8157
Polypropylene cartridge 3 ml	Applied Separation	2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge	Applied Separation	8054
Stop cocks PTFE	Applied Separation	2406
Tubes flat, 50 ml	VWR	21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes	Waters	WAT200609
Shaker, BD adams™ nutator mixer	Fisher scientific	22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml	Fisher scientific	03-312-8
Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
Heating block	Thermolyne	1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end	Fisher Scientific	14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette	Thermo	20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials – micro vl pp 400 µl PK100	VWR	69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap	VWR	66030-600
Analytical HPLC column	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge	Waters	OBD C18 5 µm column	19 mm × 150 mm
Mass spectrometer	Applied Biosystems	Voyager DE-RP