Высокочувствительного анализа для измерения ареновирус-клеток Вложение
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Аренавирусов представляют собой семейство оболочечных, одноцепочечных РНК -содержащих вирусов, которые обслуживаются в первую очередь у грызунов в природе 1-3. В то время как эти вирусы , как правило , устанавливают бессимптомное, хроническую инфекцию в грызунах водохранилищах 1,2, они могут вызвать серьезные заболевания у людей 3. Важные патогенные виды включают вирус New World Хунин (JUNV) 4 и вирус Ласса Старого Света 5, которые являются этиологическими агентами аргентинской геморрагической лихорадки в Южной Америке и лихорадки Ласса в Африке, соответственно. Лимфоцитарный вирус хореоменингита (LCMV), то прототипичный вирус семейства 6, имеет распространение во всем мире и отвечает за множества болезненных состояний , включая асептического менингита у иммунокомпетентных лиц 6, тяжелых врожденных дефектов развития плода 7 или высокой летальностью иммунодефицитом лица , следующие твердых трансплантации органов. 8,9 Отсутствие Соединенных ШтатовПищевых продуктов и медикаментов (FDA) вакцины или обсуждения и эффективные противовирусные средства для борьбы с этими вирусами подчеркивает острую необходимость в разработке новых стратегий терапевтически предназначаться для этих новых / повторно возникающих патогенных микроорганизмов.
Ареновирус геном состоит из двух одноцепочечных РНК – сегментов, большой (L) (~ 7,2 кб) и малых (S) (~ 3,6 кб) сегментов 10. Сегмент S кодирует вирусный нуклеопротеид (NP) и гликопротеин оболочки (GP) а сегмент L кодирует вирусной полимеразы (L) и матричный белок (Z). L и S геномные сегменты РНК (vRNAs) упакованы в вирионы 10-12. Начальная стадия ареновирус инфекции является прикрепление вирусных частиц к клеткам – хозяевам , через взаимодействие между вирусным GP и ее соответствующими рецепторами клеток – хозяев , которые, для JUNV, включающего человеческий рецептор трансферрина 1 (hTfR1) 13,14. После присоединения частицы JUNV взяты в клетку с помощью клатрин-эндоцитоза 15.Частицы затем трафика на поздних эндосом , где низкое значение рН этого отделения вызывает активацию GP 16,17. После активации GP-кодируемого слитого пептидные вставки в эндосомный мембраны, инициируя слияние между вирусными и эндосомальных мембран. Успешные результаты слияния в выпуске вириона упакованной vRNAs в цитоплазму, где они служат в качестве шаблонов для геномной репликации и транскрипции. Когда достаточное количество вирусных структурных белков и vRNAs образуются новые частицы собираться и бутон из инфицированной клетки , чтобы завершить жизненный цикл 18.
Для того, чтобы облегчить открытие новых стратегий для терапевтических целевых патогенных аренавирусов, наша группа была сосредоточена на выявлении факторов-хозяев, которые имеют решающее значение для распространения вируса, но необязательны для хозяина. В этом контексте, определяя точную стадию (и) жизненного цикла вируса под контролем таких факторов хозяина необходимо направлятьразработка противовирусных стратегий. Здесь мы опишем количественный (Q) ОТ-ПЦР-анализ , который может быть использован для измерения прикрепление ареновирус-клеток с целью идентификации влияют ли определенные белки , принимающие и / или противовирусные молекулы этой начальной стадии проникновения вируса 19. Альтернативные подходы к оценке вложения ареновирус-клеток фигурируют вирионов , меченные биотином 20, флуоресцентных красителей 21 или радиоактивных изотопов 22. Недостатками этих методов может включать требование больших количеств вируса ввода (например , высокая кратностью инфекции (MOI)), использование радиоактивности и / или дополнительных шагов обработки для подготовки ввода вируса (например , концентрацию и / или маркировки вируса) , В частности, использование высокой MOI делает его трудно отличить производительным по сравнению с непроизводственных вложений событий 15,23. QRT-PCR на основе анализа, описанную здесь можно обнаружить крепления события, используя всего лишь 20 зубной налет дляMing единиц (Pfus) вируса, который переводит в МВД 0,0004 для 48-луночного планшета. Таким образом, сильная чувствительность анализа преодолевает требование высокой MOI, а также любые вирусы маркировки или концентрации шагов. Кроме того, анализ может быть я), предназначенный для измерения вириона эндоцитоз, а также высвобождение вирусного генома в цитоплазму следующие слияния и II) специально для использования с другими вирусами через развитие вирус-специфических QRT-реагентов для ПЦР (примеры см 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол мы описываем прост и надежный при соблюдении следующих критических соображений. Во- первых, необходимо применять строгие предварительно ПЦР метод (см 28 для отличного обзора). Крайне важно, чтобы все реагенты и оборудование свободны от амплифицированной ДНК, содержащей ц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Маркус Thali, Натан Рой, Кристофер Ziegler, Эмили Брюс, и Бенджамин Кинг за полезные обсуждения и Национальным институтом здравоохранения для поддержки этих исследований через гранты T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), и P20RR021905 (JB) ,
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
