Ensayo muy sensible para la medición del Adjunto de células arenavirus
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenavirus son una familia de virus de ARN con envoltura de cadena simple, que se mantienen principalmente en los roedores en la naturaleza 1-3. Mientras que estos virus establecen típicamente una infección asintomática, persistente en los reservorios de roedores 1,2, que pueden causar una enfermedad grave en seres humanos 3. Especies patógenas importantes incluyen el virus Junín Nuevo Mundo (JUNV) 4 y el virus de Lassa 5 Viejo Mundo, que son los agentes etiológicos de la fiebre hemorrágica argentina en América del Sur y la fiebre de Lassa en África, respectivamente. Virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), el virus prototípico de la familia de 6, tiene una distribución mundial y es responsable de una variedad de estados de enfermedad que incluyen meningitis aséptica en individuos inmunocompetentes 6, graves defectos congénitos en el feto en desarrollo 7, o de alta letalidad en inmunodeprimidos las personas siguientes de órganos sólidos 8,9 trasplante. La falta de Estados UnidosAdministración de Alimentos y Medicamentos (FDA): aprobado vacunas o antivirales eficaces para combatir estos virus pone de relieve la necesidad crítica de desarrollar nuevas estrategias para orientar terapéuticamente estos patógenos emergentes / reemergentes.
El genoma arenavirus se compone de dos segmentos de ARN de una sola hebra, el grande (L) (~ 7,2 kb) y pequeña (S) (~ 3,6 kb) 10 segmentos. El segmento S codifica la nucleoproteína viral (NP) y glicoproteína de la envuelta (GP) mientras que el segmento L codifica la polimerasa viral (L) y la proteína de matriz (Z). La L y S segmentos de ARN genómicos (ARNv) se empaquetan en viriones 10-12. El paso inicial de la infección por arenavirus es la unión de partículas virales a las células huésped a través de una interacción entre el GP viral y sus correspondientes receptores de células huésped que, por JUNV, incluye el receptor humano de la transferrina 1 (hTfR1) 13,14. Después de la unión, las partículas JUNV se toman en la célula a través de endocitosis mediada por clatrina 15.A continuación, las partículas de tráfico para el endosoma tardío en el que el bajo pH de este compartimiento desencadena la activación de GP 16,17. Una vez activado, los insertos de péptido de fusión GP-codificado en la membrana endosomal, iniciando la fusión entre las membranas virales y endosomales. resultados de fusión de éxito en la liberación de los viriones ARNv-envasados en el citoplasma, donde sirven como plantillas para la replicación del genoma y la transcripción. Cuando se generan cantidades suficientes de proteínas estructurales virales y ARNv, nuevas partículas se reúnen y brote de la célula infectada para completar el ciclo de vida 18.
Para facilitar el descubrimiento de nuevas estrategias para apuntar terapéuticamente los arenavirus patógenos, nuestro grupo ha centrado en la identificación de factores del huésped que son críticos para la propagación de virus, pero prescindible para el huésped. En este contexto, la definición de la etapa precisa (s) del ciclo de vida viral controlada por tales factores del huésped es necesario para guiar eldesarrollo de estrategias antivirales. En este documento, se describe un ensayo cuantitativo (q) basado en RT-PCR que se puede utilizar para medir la fijación de células arenavirus con el fin de identificar si las proteínas huésped seleccionadas y / o moléculas antivirales influyen en esta etapa inicial de la entrada viral 19. Los enfoques alternativos para medir la unión de células arenavirus han ofrecido viriones marcados con biotina 20, 21 tintes fluorescentes o isótopos radiactivos 22. Los inconvenientes de estos métodos pueden incluir el requisito de grandes cantidades de virus de entrada (por ejemplo, altas multiplicidades de infección (MOI)), el uso de la radiactividad, y / o etapas de manipulación adicionales para preparar virus de entrada (por ejemplo, concentración y / o el etiquetado de virus) . En particular, el uso de alta MOI hace que sea difícil distinguir productiva frente a eventos de unión no productivas 15,23. El ensayo basado en qRT-PCR descrito aquí puede detectar eventos de unión usando tan pocos como 20 para la placaunidades Ming (UFP) del virus, lo que se traduce en una MOI de 0,0004 para una placa de 48 pocillos. Por lo tanto, la fuerte sensibilidad del ensayo supera el requisito de alta MOI, así como las medidas de etiquetado virus o de concentración. Además, el ensayo puede ser i) adaptado para medir la endocitosis del virión, así como la liberación del genoma del virus en el citoplasma después de la fusión y ii) diseñados para usar con otros virus a través del desarrollo de reactivos QRT-PCR específica para el virus (por ejemplo, véase 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo se describe es sencillo y robusto siempre que se respeten las siguientes consideraciones críticas. En primer lugar, se debe emplear una estricta técnica de pre-PCR (ver 28 para una excelente revisión). Es imperativo que todos los reactivos y equipos están libres de ADN amplificado que contiene la secuencia diana qPCR y que los controles adecuados para detectar este tipo de contaminación. En segundo lugar, por la parte de unión virus-célula del protocolo, el virus, las células y los medios…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, y Benjamín Rey útil para los debates y los Institutos Nacionales de la Salud para el apoyo de estos estudios a través de subvenciones T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), y P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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