Test très sensible pour la mesure de l'attachement arénavirus-cell
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arénavirus sont une famille de virus enveloppés, d'ARN simple brin qui sont maintenus principalement chez les rongeurs dans la nature 1-3. Bien que ces virus établissent généralement, une infection persistante asymptomatique dans les réservoirs de rongeurs 1,2, ils peuvent causer des maladies graves chez l' homme 3. Espèces pathogènes importants comprennent le virus du Nouveau Monde Junin (JUNV) 4 et le virus Lassa Vieux Monde 5, qui sont les agents étiologiques de la fièvre hémorragique argentine en Amérique du Sud et de la fièvre de Lassa en Afrique, respectivement. Virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), le virus prototypique de la famille 6, a une distribution mondiale et est responsable d'une variété d'états pathologiques , y compris la méningite aseptique chez les personnes immunocompétentes 6, des malformations congénitales graves chez le fœtus en développement 7, ou létalité élevée en immunodéprimés personnes suivantes solide transplantation d' organes 8,9. Le manque de États-UnisFood and Drug Administration (FDA) CSEh vaccins ou des antiviraux efficaces pour lutter contre ces virus met en évidence le besoin critique de développer de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement ces agents pathogènes émergents / ré-émergentes.
Le génome de arénavirus se compose de deux segments simple brin d' ARN, la grande (L) (~ 7,2 kb) et petite (S) (~ 3,6 kb) 10 segments. Le segment S code pour la nucléoprotéine virale (NP) et de glycoprotéine d'enveloppe (GP), tandis que le segment L code pour la polymerase virale (L) et de la protéine de matrice (Z). Le L et S segments d'ARN génomique (ARNv) sont emballés dans des virions 10-12. L'étape initiale de l' infection est arénavirus fixation des particules virales aux cellules hôtes par le biais d' une interaction entre le GP virale et ses récepteurs de cellules hôtes correspondantes qui, pour JUNV, comprend le récepteur de la transferrine humaine 1 (hTfR1) 13,14. Après la fixation, les particules JUNV sont prises dans la cellule par l' intermédiaire de la clathrine endocytose 15.Les particules puis la circulation à la fin du endosome où le faible pH de ce compartiment déclenche l'activation du GP 16,17. Une fois activés, les inserts peptide de fusion GP-codées dans la membrane endosomale, initiant la fusion entre les membranes virale et endosomique. Résultats de la fusion réussie dans la libération des ARNv de virions-emballés dans le cytoplasme, où ils servent de modèles pour la réplication génomique et de la transcription. Lorsque des quantités suffisantes de protéines et ARNv structurales virales sont générées, de nouvelles particules se rassemblent et le bourgeon de la cellule infectée pour terminer le cycle de vie de 18 ans.
Pour faciliter la découverte de nouvelles stratégies pour cibler thérapeutiquement les arénavirus pathogènes, notre groupe a mis l'accent sur l'identification des facteurs de l'hôte qui sont essentiels pour la propagation du virus, mais dispensable pour l'hôte. Dans ce contexte, définissant le moment précis (s) du cycle de vie viral contrôlé par ces facteurs de l'hôte est nécessaire pour guider ledéveloppement de stratégies antivirales. Nous décrivons ici une analyse quantitative (q) de test à base de RT-PCR qui peut être utilisée pour mesurer la fixation arénavirus des cellules dans le but d'identifier si les protéines hôtes choisies et / ou des molécules antivirales influencent cette phase initiale de la pénétration du virus 19. D' autres approches pour mesurer l' attachement arénavirus cellules ont présenté des virions marqués avec de la biotine 20, des colorants fluorescents 21, ou des isotopes radioactifs 22. Les inconvénients de ces méthodes peuvent inclure l'exigence de grandes quantités de virus d'entrée (par exemple , des multiplicités élevés d'infection (MOI)), l'utilisation de la radioactivité et / ou d' étapes de manipulation supplémentaires pour préparer le virus de l' entrée (par exemple , la concentration et / ou l' étiquetage des virus) . En particulier, l'utilisation de MOI élevé, il est difficile de faire la distinction productive par rapport à des événements de fixation improductives 15,23. Le test à base de qRT-PCR décrit ici peut détecter des événements de fixation en utilisant aussi peu que 20 pour la plaqueunités ming (UFP) du virus, ce qui se traduit par une MOI de 0,0004 pour une plaque de 48 puits. Par conséquent, la forte sensibilité de l'essai surmonte l'exigence de MOI élevé, ainsi que des mesures d'étiquetage de virus ou de concentration. En outre, le dosage peut être i) adapté pour mesurer virion endocytose ainsi que la libération du génome du virus dans le cytoplasme suivant la fusion et ii) adapté pour une utilisation avec d'autres virus à travers le développement de réactifs qRT-PCR spécifiques du virus (pour des exemples, voir 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole que nous décrivons est simple et robuste à condition que les considérations critiques suivantes sont respectées. Tout d' abord, la technique stricte pré-PCR doit être utilisé (voir 28 pour une excellente revue). Il est impératif que tous les réactifs et le matériel sont exempts d'ADN amplifié contenant la séquence cible qPCR et que les contrôles appropriés sont en place pour détecter une telle contamination. Deuxièmement, pour la partie de fixation virus-cellule du protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, et Benjamin roi pour des discussions utiles et les National Institutes of Health pour le soutien de ces études par le biais de subventions T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), et P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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