Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenaviruses 자연 1-3 설치류에서 주로 유지 포위, 단일 가닥 RNA 바이러스의 가족입니다. 이 바이러스는 일반적으로 설치류 저수지 1,2의 증상, 지속적인 감염을 설정하는 동안, 그들은 인간 3 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 중요 병원성 종은 새로운 세계 후닌 바이러스 (JUNV) 4 아프리카에서 남미, 라사 열에서 아르헨티나 출혈열의 병원체가 각각있는 올드 월드 라사 바이러스 (5)를 포함한다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 가정 (6)의 본보기 바이러스는 전 세계적으로 분포가 면역 억제의 면역 개인 6 무균 성 뇌막염, 태아 7 심각한 선천성 또는 높은 치사율을 포함하는 다양한 질환 상태에 대한 책임 고체 장기 이식 8,9 다음 개인. 미국의 부족식품의 약국 (FDA)은 백신 이들 바이러스에 대처하기 위해 효과적인 항 바이러스제는 치료 이들 신흥 / 재 신흥 병원균을 대상으로 새로운 전략을 개발하는 중요한 필요성을 강조 -approved.
arenavirus 게놈 두 개의 단일 가닥 RNA 세그먼트, 대형 (L) (~ 7.2 킬로바이트) 작은 (S) (~ 3.6 킬로바이트) 세그먼트 (10)로 구성되어 있습니다. L 세그먼트가 바이러스 폴리머 라제 (L) 및 매트릭스 단백질 (Z)을 인코딩하는 동안 S 세그먼트 바이러스 핵 단백질 (NP)과 외피 당 단백질 (GP)을 인코딩한다. L과 S 게놈 RNA 세그먼트 (vRNA들)은 비리 10-12로 포장됩니다. arenavirus 감염의 초기 단계는 바이러스 입자의 부착 JUNV 들어 인간 트랜스페린 수용체 1 (hTfR1) (13, 14)과, 바이러스 GP 및 해당 숙주 세포 수용체 사이의 상호 작용을 통해 세포를 호스팅한다. 부착 후, JUNV 입자는 클라 트린 매개 엔도 시토 시스 (15)를 통해 세포로 수행한다.입자이 구획의 낮은 pH가 GP 16, 17의 활성화를 유발 후반 엔도 좀에 다음 트래픽. 일단 바이러스와 엔도 솜 막의 융합을 개시 사이, GP 부호화 융합 펩티드 삽입 엔도 솜 막으로 활성화. 그들은 게놈 복제 및 전사에 대한 템플릿 역할을 세포질에 비리 패키지 vRNA들의 릴리스의 성공적인 융합의 결과. 바이러스의 구조 단백질과 vRNA들의 충분한 양이 생성되는 경우, 새로운 입자가 조립하고 감염된 세포에서 새싹 라이프 사이클 (18)를 완료합니다.
치료 병원성 arenaviruses 타겟팅 새로운 전략의 발견을 용이하게하기 위해, 우리 그룹은 호스트에 대한 바이러스 증식에 중요하지만, 폐기 가능하다 호스트 요소의 식별에 초점을 맞추고있다. 이러한 맥락에서, 이러한 숙주 요인에 의해 제어 바이러스 생활주기의 정확한 스테이지 (들)를 형성하는 안내 할 필요가있다항 바이러스 전략의 개발. 여기서, 우리는 선택된 숙주 단백질 및 / 또는 바이러스 분자 바이러스 엔트리 (19)의 초기 단계에 영향 여부를 식별하기위한 목적 arenavirus 세포 부착을 측정 할 수 정량 (Q) RT-PCR 기반 분석법을 설명한다. arenavirus 세포 부착을 측정하는 다른 방법은 비오틴 (20), 형광 염료 (21), 또는 방사성 동위 원소 (22)으로 표시 비리를 추천했다. 이러한 방법에 대한 단점은 입력 바이러스의 대량 방사능의 사용 (감염 (MOI)의 예를 들면 높은 다중도), 및 / 또는 입력 된 바이러스 (예를 들어, 농도 및 / 또는 바이러스의 표시)을 제조하기위한 추가 처리 단계들에 대한 요구 사항을 포함 할 수있다 . 특히, 높은 MOI를 사용하는 것이 곤란 비생산적인 부착 이벤트 15,23 비해 생산성을 구별 할 수있다. 여기에 설명 된 QRT-PCR 기반의 분석은 거의 20 패에 대한을 사용하여 첨부 이벤트를 검색 할 수 있습니다밍 단위 48 웰 플레이트에 대해 0.0004의 MOI로 변환 바이러스 (PFUs). 따라서, 분석의 감도가 강한 높은 MOI 대한 요구뿐만 아니라 바이러스 라벨 또는 농도 단계를 극복한다. 또한, 분석 내가) 비리의 엔도 사이토 시스를 측정 할뿐만 아니라 세포질에 바이러스 게놈의 방출 등의 융합에 따라하도록하고 ⅱ) 예제 바이러스 특정 QRT-PCR 시약의 개발을 통해 다른 바이러스와 함께 사용 (위해 맞춤형 할 수 있습니다 참조 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 설명하는 프로토콜은 간단하고 강력한는 다음과 같은 중요한 고려 사항이 관찰된다 제공했다. 첫째, 엄격한 사전-PCR 기술은 (우수한 검토를 위해 28 참조) 고용해야합니다. 모든 시약 및 장비 qPCR의 표적 서열을 함유하는 증폭 된 DNA의 자유 및 적절한 제어가 이러한 오염을 검출하는 위치에있는 것이 필수적이다. 둘째, 프로토콜, 바이러스, 세포, 및 미디어 바이러스 세포 부착 부에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 보조금 T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), 및 P20RR021905을 통해 이러한 연구의 지원에 도움이 토론과 국립 보건원 (JB)에 대한 마르쿠스 Thali, 나단 로이, 크리스토퍼 지글러, 에밀리 브루스, 베냐민 왕 감사합니다 .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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