الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenaviruses هي عائلة يلفها فيروسات الحمض النووي الريبي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، التي يتم الاحتفاظ بها في المقام الأول في القوارض في الطبيعة 1-3. في حين أن هذه الفيروسات عادة بإنشاء عديمة الأعراض والتهاب مستمر في الخزانات القوارض 1،2، فإنها يمكن أن تسبب المرض الشديد في البشر 3. وتشمل الأنواع المسببة للأمراض الهامة الفيروس العالمي الجديد جونين (JUNV) (4) وفيروس العالم القديم لاسا 5، والتي هي وكلاء خاص بأسباب الأمراض الحمى النزفية الأرجنتينية في أمريكا الجنوبية وحمى لاسا في أفريقيا، على التوالي. الليمفاوي فيروس التهاب السحايا المشيمي (LCMV)، وفيروس prototypic الأسرة 6، له توزيع في جميع أنحاء العالم، وهي مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما في ذلك التهاب السحايا العقيم في الأفراد المناعة 6، عيوب خلقية خطيرة في الجنين 7، أو القتل العالية في كبت المناعة الأشخاص التالية أسماؤهم الصلبة الجهاز زرع 8،9. عدم وجود الولايات المتحدةوافق عليها إدارة الغذاء والدواء (FDA) اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات فعالة لمكافحة هذه الفيروسات يسلط الضوء على الحاجة الماسة إلى وضع استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا هذه الجراثيم الناشئة / إعادة الناشئة.
يتكون الجينوم الفيروسة الرملية من جزأين واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي، وكبير (L) (~ 7.2 كيلوبايت) والصغيرة (S) (~ 3.6 كيلو بايت) شرائح 10. الجزء S بترميز البروتين النووي الفيروسي (NP) وبروتين سكري مغلف (GP) في حين أن شريحة L بترميز البلمرة الفيروسي (L) والبروتين مصفوفة (Z). يتم تعبئتها من L و S شرائح الحمض النووي الريبي الجينوم (vRNAs) في virions 10-12. الخطوة الأولى للعدوى الفيروسة الرملية هو مرفق من الجسيمات الفيروسية لاستضافة الخلايا من خلال التفاعل بين GP الفيروسي ومستقبلات الخلايا المضيفة المقابلة لها والتي، على JUNV، يتضمن ترانسفيرين مستقبل بشري 1 (hTfR1) 13،14. وعقب المرفق، يتم أخذ جزيئات JUNV داخل الخلية عبر بوساطة بالكلاذرين الإلتقام 15.الجسيمات ثم المرور إلى أواخر الاندوسوم حيث درجة الحموضة منخفضة من هذا الحيز مشغلات تفعيل GP 16،17. تنشيط مرة واحدة، وترميز GP إدراج الانصهار الببتيد في غشاء endosomal، وبدء الانصهار بين الأغشية الفيروسية وendosomal. النتائج الاندماج الناجحة في الإفراج عن vRNAs المعبأة الفيريون إلى السيتوبلازم، حيث أنها بمثابة نماذج للنسخ المتماثل الجيني والنسخ. عندما تتولد كميات كافية من البروتينات وvRNAs الهيكلية الفيروسية، والجسيمات الجديدة بالتجمع وبرعم من الخلية المصابة لاستكمال دورة الحياة 18.
لتسهيل اكتشاف استراتيجيات جديدة لاستهداف علاجيا وarenaviruses المسببة للأمراض، وركزت مجموعتنا على تحديد العوامل المضيفة التي تعتبر بالغة الأهمية لانتشار الفيروس، ولكن يمكن الاستغناء عنها للمضيف. في هذا السياق، وتحديد مرحلة دقيقة (ق) من دورة حياة الفيروس التي تسيطر عليها عوامل المضيف مثل هذه لا بد من توجيهتطوير الاستراتيجيات المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف (ف) فحص الكمي استنادا RT-PCR والتي يمكن استخدامها لقياس التعلق خلية الفيروسة الرملية لغرض تحديد ما إذا كانت بروتينات المضيف المحدد و / أو الجزيئات المضادة للفيروسات تؤثر هذه المرحلة الأولية من دخول الفيروس 19. وقد ظهرت أساليب بديلة لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلايا virions المسمى مع البيوتين 20، الأصباغ الفلورية 21، أو النظائر المشعة 22. عيوب هذه الطرق يمكن أن تشمل متطلبات كميات كبيرة من الفيروس المدخلات (مولتيبليكيتييس عالية من العدوى (وزارة الداخلية))، واستخدام النشاط الإشعاعي، و / أو التعامل معها خطوات إضافية لإعداد فيروس الإدخال (مثل التركيز و / أو وضع العلامات من الفيروسات) . على وجه الخصوص، واستخدام عالية وزارة الداخلية يجعل من الصعب التمييز الإنتاجي مقابل الأحداث التعلق غير منتجة 15،23. مقايسة على أساس QRT-PCR وصفها هنا يمكن الكشف عن أحداث المرفق باستخدام عدد قليل من 20 لوحة لوحدات مينغ (PFUs) من الفيروس، وهو ما يترجم إلى وزارة الداخلية من 0.0004 لوحة 48-جيدا. ولذلك، فإن حساسية قوية للمقايسة يتغلب متطلبات عالية وزارة الداخلية، فضلا عن أي خطوات وضع العلامات فيروس أو التركيز. وعلاوة على ذلك، يمكن للفحص أن يكون ط) تكييفها لقياس الفيريون الإلتقام وكذلك الإفراج عن جينوم الفيروس إلى السيتوبلازم بعد الانصهار والثاني) مصممة خصيصا للاستخدام مع الفيروسات الأخرى من خلال تطوير الكواشف QRT-PCR الفيروس محددة (للحصول على أمثلة، انظر 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول وصفنا واضح ومباشر، وقدم قوية ويلاحظ الاعتبارات الهامة التالية. أولا، يجب أن توظف صارمة قبل PCR تقنية (انظر 28 للاستعراض ممتاز). لا بد من أن جميع الكواشف والمعدات خالية من تضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على تسلسل الهدف QPCR والضوابط المناسبة في مكانها الصح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماركوس ثالي، ناثان روي، كريستوفر زيغلر، إميلي بروس، وبنيامين الملك لإجراء مناقشات مفيدة والمعاهد الوطنية للصحة لدعم هذه الدراسات من خلال المنح T32 AI055402 (JK)، R21 AI088059 (جي بي)، وP20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
