JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Published: March 02, 2016
doi:
10.3791/53682
,
1Department of Medicine, Division of Immunobiology,University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics,University of Vermont

Summary

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Abstract

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

Introduction

Arenaviruses doğada 1-3, kemirgenlerde esas korunur saran, tek iplikçikli RNA virüslerinden oluşan bir ailesidir. Bu virüsler genellikle kemirgen rezervuarların 1,2 asemptomatik, kalıcı enfeksiyon kurmak olsa da, insanlarda 3 şiddetli hastalığa neden olabilir. Önemli patojenik türler Yeni Dünya Junin virüsü (JUNV) 4 ve Afrika'da Güney Amerika ve Lassa ateş Arjantin hemorajik ateş etiyolojik ajanları sırasıyla, Old World Lassa virüsü 5 içerir. Lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV), ailenin 6 prototipik virüs, dünya çapında bir dağılımına sahiptir ve bağışıklık sistemi baskılanmış olarak immün sistemi sağlıklı bireylerde 6 aseptik menenjit, gelişmekte olan fetusta 7 ciddi doğum kusurlarına veya yüksek öldürücülüğü dahil hastalık durumlarında çeşitli sorumludur solid organ transplantasyonu 8,9 aşağıdaki bireyler. Amerika Birleşik Devletleri eksikliğiGıda ve İlaç İdaresi (FDA) aşılar ya da bu virüs ile mücadele için etkili antiviral tedavi, ortaya çıkan bu / yeniden ortaya çıkan patojenleri hedef yeni stratejiler geliştirmek için kritik ihtiyacının altını çizmektedir -onaylı.

Arenavirüs genomu iki tek-şeritli RNA segmenti, büyük (L) (~ 7.2 kb) ile küçük (S), (~ 3.6 kb) segmentleri 10 oluşur. L kademeli bir viral polimeraz (L) ve matris protein (Z) kodlar ise S kademeli bir virüs nükleoprotein (NP) ve zarf glikoproteini (GP) kodlar. L ve S genomik RNA segmenti (vRNAs) virionlar 10-12 içinde ambalajlandı. Arenavirüs enfeksiyonun başlangıç ​​aşaması, viral parçacıkların ek JUNV için, insan transferin reseptörü 1 (hTfR1) 13,14 içerir viral GP ve karşılık gelen konakçı hücre reseptörleri arasındaki bir etkileşim yoluyla konakçı hücreler sağlamaktır. Bağlanmasının ardından, JUNV parçacıklar klatrin dolayımlı endositoz 15 ile hücre içine alınır.Parçacıklar bu bölmenin düşük pH GP 16,17 aktivasyonunu tetikler geç Endozom sonra trafik. Bir kez viral ve endozomal membranların arasındaki kaynaşmayı başlatarak, GP-kodlanmış füzyon peptid ekler endozomal zarı içine, aktif. Onlar genomik replikasyon ve transkripsiyon için şablon olarak hizmet sitoplazma içine viryon paketlenmiş vRNAs serbest bırakılması Başarılı füzyon sonuçları. Viral yapısal proteinler ve vRNAs yeterli miktarda üretilir, yeni parçacıkların araya ve enfekte olmuş hücreden tomurcuk ömrü 18 tamamlayın.

terapötik patojenik arenaviruses hedeflenecek yeni stratejilerin keşfini kolaylaştırmak için, bizim grup ev sahibi için virüs yayılımı için kritik, ama vazgeçilebilir olan konak faktörlerinin belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bu bağlamda, bu gibi konakçı faktör ile kontrol virüs ömrü çevrimi kesin aşama (lar) tanımlayan kılavuz için gerekli olanAntiviral stratejilerin geliştirilmesi. Burada, seçilen konakçı proteinleri ve / veya antiviral moleküller viral giriş 19, bu ilk aşamasına etkileyen olmadığının belirlenmesi amacıyla, arenavirüs hücre eki ölçmek için kullanılabilecek bir miktar (Q), RT-PCR bazlı analiz tarif eder. Arenavirüs hücre eki ölçmek için alternatif yaklaşımlar biyotin 20, floresan boyalar 21 veya radyoaktif izotoplar 22 ile etiketlenmiş virionlar özellikli var. Bu yöntemlere dezavantajları, giriş virüsünün büyük miktarlarda radyoaktivite kullanımı (enfeksiyon (MOI) arasında örneğin yüksek çokluklar), ve / veya girdi virüs (örneğin, konsantrasyon ve / veya virüs etiketleme) hazırlanması için ek işleme adımları için gereksinimi içerebilir . Özellikle, yüksek İçişleri kullanımı zor nonprodüktif eki olayları 15,23 karşı üretken ayırt etmek yapar. Burada anlatılan QRT-PCR tabanlı tahlil kadar az 20 olarak plaket kullanılarak eki olaylarını algılayabilirMing birimleri, 48-delikli plaka için 0.0004 MOI anlamına virüs (pfus). Bu nedenle, tahlil güçlü duyarlılığı yüksek İçişleri Bakanlığı için gereksinimi yanı sıra herhangi bir virüs etiketleme ya da konsantrasyon adımları üstesinden gelir. Bundan başka, deney I) viryon endositozu ölçmek hem de sitoplazmaya virüs genomunun serbest bırakılması gibi füzyon şu şekilde uyarlanmış ii) örnekleri için virüs özel QRT-PCR geliştirilmesi yoluyla diğer virüsler ile kullanım için (özel olabilir, bkz 24-27).

Protocol

Not: açıklanan protokol (pre-PCR laboratuvarı ve ne kadar iyi öncesi PCR tekniği kullanılarak deneyler kurmak için nasıl mükemmel bir bakış için 28 bakınız) sıkı öncesi PCR tekniği kullanılarak yapılmalıdır önemlidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. Protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir. 1. 48-iyi …

Representative Results

Protokol bölüm 4'te tarif edildiği gibi qPCR tahlilin hassasiyetini ve dinamik aralığını göstermek için, JUNV Cı 1. (aralık 5-5 x 10 7 kopya) NP genini kodlayan bir plazmid bilinen miktarlarda qPCR tabi tutuldu. Deney hassastır ve güvenilir bir şekilde, hedef nükleik asidin 5 kopya (Şekil 2) gibi birkaç algılayabilir. Şablonun en az 7 günlükleri kapsayabilir, Şekil 2'de de gösterildiği gibi, tahlilin dinamik ara…

Discussion

biz tarif protokol basittir ve sağlam aşağıdaki kritik hususlar görülmektedir sağladı. İlk olarak, sıkı öncesi PCR tekniği (mükemmel bir inceleme için 28 bakınız) istihdam edilmelidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. İkinci olarak, iletişim kuralı, virüs, hücreler ve ortamın virüs-hücre bağlanma bölümü için yüzeyine bağlı viryonlann endositoz ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hibe T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ve P20RR021905 aracılığıyla bu çalışmaların destek için yararlı tartışmalar ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (JB) için Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce ve Benjamin Kral teşekkür .

Materials

DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).

Tags

ArenavirusVirus AttachmentVirus EndocytosisVirus FusionVero E6 CellsJunin Candid 1 VirusFocus Forming UnitsPlaque Forming UnitsRNA IsolationCell Lysis
check_url/53682?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image