Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment
Summary
The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.
Abstract
Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.
Introduction
Arenavirussen zijn een familie van omhulde, enkelstrengs RNA-virussen die voornamelijk gevoerd knaagdieren aard 1-3. Hoewel deze virussen meestal vast een asymptomatische, aanhoudende infectie bij knaagdieren reservoirs 1,2, kunnen ze ernstige ziekte bij de mens veroorzaken 3. Belangrijke pathogene soorten zijn de Nieuwe Wereld Junin virus (JUNV) 4 en de Oude Wereld Lassa virus 5, waarbij de etiologische agenten van de Argentijnse hemorragische koorts in Zuid-Amerika en Lassa koorts in Afrika, respectievelijk. Lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV), het prototype virus van de familie 6, heeft een wereldwijde verspreiding en is verantwoordelijk voor een aantal ziektetoestanden waaronder aseptische meningitis bij immuuncompetente individuen 6, ernstige aangeboren afwijkingen bij de foetus 7 of hoge letaliteit immunosuppressieve individuen na solide-orgaantransplantatie 8,9. Het ontbreken van Verenigde StatenFood and Drug Administration (FDA) -goedgekeurd vaccins of effectieve antivirale middelen om deze virussen te bestrijden wijst op de absolute noodzaak om nieuwe strategieën voor het therapeutisch deze opkomende / re-opkomende ziekteverwekkers te ontwikkelen.
De arenavirus genoom bestaat uit twee enkelstrengige RNA-segmenten, de grote (L) (~ 7,2 kb) en klein (S) (~ 3,6 kb) segmenten 10. De S-segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en envelop glycoproteïne (GP), terwijl de L-segment codeert voor het virale polymerase (L) en matrix eiwit (Z). De SL en genomische RNA segmenten (vRNA's) worden verpakt in virions 10-12. De eerste stap van arenavirus infectie hechting van virale partikels aan gastheercellen via een interactie tussen de virale huisarts en de bijbehorende gastheercel receptoren die voor JUNV, omvat de menselijke transferrinereceptor 1 (hTfR1) 13,14. Na bevestiging worden JUNV deeltjes in de cel genomen via clathrine-gemedieerde endocytose 15.Deeltjes dan verkeer naar de late endosoom waar de lage pH van dit compartiment het startsein voor de activering van GP 16,17. Eenmaal geactiveerd, de GP-gecodeerde fusiepeptide inserts in de endosomale membraan, het initiëren van fusie tussen de virale en endosomale membranen. Succesvolle combinatie resulteert in het vrijkomen van het virion verpakt vRNA's in het cytoplasma, waar ze dienen als matrijzen voor genomische replicatie en transcriptie. Wanneer voldoende hoeveelheden virale structurele proteïnen en vRNA's worden gegenereerd, nieuwe deeltjes monteren en de knop van de geïnfecteerde cel naar de levenscyclus 18 ronden.
Tot de ontdekking van nieuwe strategieën vergemakkelijken het therapeutisch pathogene arenavirussen, heeft onze fractie gericht op de identificatie van gastheer factoren die kritiek zijn voor viruspropagatie, maar overbodig voor de gastheer. In dit verband vaststellen van de precieze fase (n) van de virale levenscyclus worden gecontroleerd door deze gastheerfactoren moet de leidraadontwikkeling van antivirale strategieën. Hierin beschrijven we een kwantitatief (q) RT-PCR gebaseerde bepaling die kan worden gebruikt om arenavirus-celhechting voor de identificatie of geselecteerde gastheer- en / of antivirale moleculen beïnvloeden deze eerste fase van virale ingang 19 meten. Alternatieve benaderingen arenavirus-celhechting te meten hebben gekenmerkt virionen gelabeld met biotine 20, fluorescerende kleurstoffen 21, of radioactieve isotopen 22. Nadelen van deze methoden kan de vereiste grote hoeveelheden toegevoegd virus (bijvoorbeeld hoge multipliciteit van infectie (MOI)), het gebruik van radioactiviteit en / of aanvullende behandelingsstappen aan toegevoegd virus (bijvoorbeeld concentratie en / of het etiket van virus) te bereiden omvatten . Met name het gebruik van hoge MOI maakt het moeilijk om onderscheid te maken productief versus niet-productieve gehechtheid gebeurtenissen 15,23. De qRT-PCR-gebaseerde test die hier beschreven kunnen attachment gebeurtenissen detecteren met behulp van zo weinig als 20 plaque voorming eenheden (PVE) virus, wat zich vertaalt in een MOI van 0,0004 voor een 48-wells plaat. Daarom is de sterke gevoeligheid van de test overwint de behoefte aan hoog traagheidsmoment en virussen etikettering of concentratiestappen. Verder kan de assay i) ingericht om virion endocytose meten en afgifte van virusgenoom in het cytoplasma volgende fusie en ii) aangepast zijn voor andere virussen door de ontwikkeling van virus-specifieke qRT-PCR reagentia (voor voorbeelden zie 24-27).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschrijven we is eenvoudig en robuust op voorwaarde dat de volgende kritische beschouwingen in acht worden genomen. Ten eerste moet een strikte pre-PCR-techniek worden toegepast (zie 28 voor een uitstekende beoordeling). Het is absoluut noodzakelijk dat alle reagentia en apparatuur zijn vrij van versterkte DNA dat de qPCR doelsequentie en dat er passende controles zijn om een dergelijke besmetting op te sporen. Ten tweede, voor het virus-celhechting deel van het protocol, het virus, cellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, en Benjamin King nuttige discussies en de National Institutes of Health voor de ondersteuning van deze studies door middel van subsidies T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) en P20RR021905 (JB) .
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. . The Arenaviridae. , 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. Ch. 50. Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. . Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. . Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
