Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
במחקרי תעתיק נעשו ברמת הרקמה, transcriptomes של סוגי תאים מיוחדים אבל נדירים מאוד לעתים קרובות הם רעול פנים על ידי התאים שמסביב שופעים יותר. דוגמא עבור תאים מסוגים אלה מאוד מיוחדים הם התאים של שושלת הרבייה הנשית (germline) בצמחים. Germline הנקבה המצוין בתוך ביציות מתפתחות, המבשרים של זרעים בתוך gynoecium של 1,2 הפרח. תא אמא megaspore (MMC) הוא התא הראשון של germline הנשי. זה עובר המיוזה לגבש הטטרדה של megaspores מופחת. בדרך כלל, רק אחד megaspores אלה שורד ומחלק mitotically ללא cytokinesis, כלומר, בתוך syncytium. mitoses אלה ואחריו cellularization כדי ליצור את גמטופיט הבוגרת, אשר בדרך כלל מורכב מארבעה סוגי תאים: שלושה antipodals, שני תאים synergid, ביצה, והתא המרכזי. תאי הביצה ומרכזיים הם הגמטות נקבה כי לקבל מופרת על ידי שני תאי זרע במהלך douהפריה ble כדי להצמיח את העובר ואת האנדוספרם של 1,2 הזרע המתפתח. ב thaliana ארבידופסיס מערכת מודל המיני, רק ~ 50 זרעים לפתח לכל פרח בעוד כ -50 – 80 זרעים לפתח לכל פרח הסוג הקשור קשר ההדוק Boechera. לפיכך, germline הנשי מורכב רק כמה מאוד סוגי תאים מיוחדים, מה שהופך אותו מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים, כגון תא מפרט והבחנה.
יתר על כן, תובנה התהליכים רגולטוריים גן מסדירי רביית צמח יכולות להיות בעל ערך שימושי. בצמחים, הוא רבייה מינית מינית באמצעות זרעים (apomixis) יכולה להתרחש. בעוד רבייה מינית מייצר מגוון גנטי באוכלוסייה, apomixis מוביל להיווצרות של צאצא משובט זהה גנטי לצמח האם. לכן, apomixis יש פוטנציאל גדול עבור יישומי חקלאות וייצור זרע, כמו גנוטיפים אימהי מורכב אפילו יכוללהישמר ללא שינוי במשך כמה דורות 3,4,5. בגלל apomixis אינו מתרחש באופן טבעי בכל מיני יבול עיקריים, ההנדסה של apomixis בגידולים הוא של 3,4,5 עניין רב. עם זאת, המטרה ארוך הטווח הזה קשה להשיג כי הבסיס הגנטי ואת המולקולריים שבבסיס של apomixis אינו מובן בפירוט מספיק 6.
כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס תעתיק המסדירים רבייה apomictic, פרופיל תעתיק סוג תא ספציפי באמצעות microdissection לייזר בסיוע (LAM) וסדר הדור הבא (NGS) מייצג גישה מאוד חזק 7,8. LAM הוקם הראשון עבור בעלי חיים המחקר הביו-רפואי. בשנים האחרונות LAM גם יושם לביולוגיה צמח 6,9,10. בניגוד לשיטות אחרות המאפשרות אפיון של סוגי תאים ורקמות פרט, LAM אינו מחייב את הדור של קווי סמן 6,9,10. לכן, זה יכול להיות אפליקציהשייקר סוג תא או רקמה שהיא ללא ידע מולקולרי מוקדם. יתרון נוסף של LAM הוא שזה יכול להיות מיושם על כל סוג תא כל עוד התא ניתן להכיר בסעיפים יבשים על בסיס מיקום ו / או תכונות מבניות. יש LAM יתרון הנוסף רקמות קבועות משמשות, אשר מונע שינויים של פרופיל התעתיק במהלך עיבוד.
הרקמה של עניין, למשל, רקמת פרחים, הוא קבוע מקבע הלא crosslinking לפני הטבעה ב פרפין. שיבוץ שעוות פרפין ניתן לעשות זאת באופן ידני, לאחר פרוטוקולים הוקמו 9,11. עם זאת, השימוש של מעבד רקמות אוטומטי התייבשות וחדירה עם השעווה בדרך כלל תוצאות שחזור גבוה במונחים של שימור איכות RNA ומורפולוגיה רקמות. האסטרטגיה החלופית הטבעת רקמות שרף גם שמשה בהצלחה עבור ניתוחי סוג תא ספציפי על ידי LAM 8. עם זאת, השימוש של automמעבד רקמות ated מוטבע שעווה מאוד זמן יעיל, כפי שניתן לעבד דגימות רבות בבת אחת המחייב מינימום של הידיים על הזמן. בעוד בדרך כלל ללא אובדן משמעותי של איכות RNA מתרחש במהלך קיבעון והטבעה, הכנת חלקים דקים עם microtome ו, בפרט, גוברת על frameslides המשמש LAM נשארה צעד קריטי לשמירה על איכות RNA. זה כבר ציין בעבר ושימוש מערכת העברת קלטת תואר לגרום איכות RNA טובה יותר בשלב זה 12. עם זאת, זה מוסיף נדבך נוסף גוזל זמן במהלך תקופת ההכנה של השקופיות וגם דורש ציוד מיוחד. פרוטוקול אופטימיזציה המתואר להלן reproducibly מייצרת RNA כי הוא באיכות מספקת עבור פרופיל תעתיק עם GeneCHIPs ואת הדור הבא הרצף (NGS) מתקרב 7,11,13,14. בנוסף, עם מיקרוסקופ microdissection הליזר המשמש, טוהר גבוה של סוגי התאים המבודדים היא תבוסהinely מיוצר 7,11,13,14.
סוג Boechera היא מערכת מודל מצוינת לחקר השלבים העיקריים של רביית apomictic. בשנת Boechera, מגוון של הצטרפויות מיניות apomictic שונים זוהה וניתן להשתמש בו עבור השוואתי מנתח 15,16,17. בהשוואת transcriptomes סוג תא ספציפי של תאים מן germline נקבה מן ארבידופסיס מינית apomictic Boechera, זיהינו גנים ושבילים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, ובכך לזהות היבטים חדשים של תהליכים רגולטוריים המסדירים apomixis 7. בנוסף, מחקר זה אימת את התאמתו של LAM עבור תעתיק סוג תא ספציפי מנתח של סוגי תאים קטנים ונדירים. אנחנו כבר השתמשנו בפרוטוקול זה לניתוח של תאים מסוגים שונים במגוון של מיני צמחים, אבל מינים ושינויים ספציפי רקמות לפרוטוקול עשויים להידרש במקרים מסוימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הוא מתאים תאים שונים וסוגי רקמות
LAM בשילוב עם transcriptome מנתח ידי microarrays או RNA-seq היא כלי רב ערך כדי לקבל תובנות לתוך דפוסים מסוימים של פעילות גנים ויסות תהליכים התפתחותיים או פיזיולוגיים 7-11,13,14. עם זאת, את התאמ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
