Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
В транскрипционных исследованиях, проведенных на уровне тканей, Транскриптом узкоспециализированных, но редких типов клеток часто маскируется более обильными окружающих клеток. Примером таких узкоспециализированных типов клеток являются клетки женской репродуктивной линии (зародышевой) в растениях. Самка зародышевой задается в развивающихся яйцеклеток, предшественники семян внутри гинецеем цветочной 1,2. Мегаспор материнская клетка (MMC) является первой ячейкой женского зародышевых. Он подвергается мейоза с образованием тетраду восстановленных мегаспор. Как правило, только один из этих мегаспор выживает и делит митотически без цитокинеза, то есть, в синцитий. Эти митозы следуют cellularization с образованием зрелого гаметофит, который, как правило, состоит из четырех типов клеток: три antipodals, два synergid клетки, яйца и центральной клетки. Яичные и центральные клетки являются женские гаметы, которые получают оплодотворенные двумя сперматозоидами во время доуBLE оплодотворение , чтобы дать начало зародыша и эндосперма Проявочной семян 1,2. В сексуальной модели системы Резуховидка Таля, только ~ 50 семян развиваются на цветок в то время как около 50 – 80 семян развиваются на цветок в тесно связанного рода Boechera. Таким образом, самка зародышевой состоит из всего лишь нескольких узкоспециализированных типов клеток, что делает его отличной моделью для изучения процессов развития, такие как спецификации и дифференцировки клеток.
Кроме того, способность проникновения в суть регуляторных процессов генов, регулирующих размножение растений может быть прикладной ценности. У растений, как половое и бесполое размножение через семена (апомиксису) может произойти. В то время как половое размножение создает генетическое разнообразие в популяции, апомиксис приводит к образованию клонального потомства, генетически идентичны материнского растения. Поэтому апомиксису имеет большой потенциал для применения в сельском хозяйстве и производстве семян, так как даже сложные материнские генотипы могутподдерживаться неизменным на протяжении нескольких поколений 3,4,5. Поскольку апомиксису , естественно , не происходит ни в одном основных видов сельскохозяйственных культур, инженерный апомиксиса в посевах представляет большой интерес 3,4,5. Тем не менее, это долгосрочная цель трудно достичь , потому что основной генетический и молекулярная основа апомиксисом не понята достаточно подробно 6.
Для того, чтобы получить представление о транскрипционной основе , регулирующие апомиктическое воспроизводства, типа клеток специфических транскрипционных профилирование с помощью с помощью лазера микродиссекции (LAM) и следующего поколения секвенирования (NGS) представляет собой очень мощный подход 7,8. LAM сначала был создан для животных и биомедицинских исследований. За последние несколько лет LAM также применяется к биологии растений 6,9,10. В отличие от других способов , позволяющих профилирование отдельных клеток и тканей типов, Lam не требует генерации маркерных линий 6,9,10. Таким образом, это может быть приложениелгал любой клетки или ткани типа без предварительного молекулярного знания. Еще одним преимуществом является то, что LAM он может быть применен к любому типу клеток до тех пор, как клетка может быть распознана в сухих участках в зависимости от положения и / или структурных характеристик. LAM имеет дополнительное преимущество в том, что используются фиксированные ткани, что предотвращает изменения транскрипционного профиля во время обработки.
Ткани интерес, например, цветочной ткани, фиксируется в несшивающий закрепителя до встраивания в парафин. Вложение в парафин может быть сделано вручную, в соответствии с установленными протоколами 9,11. Тем не менее, использование автоматизированного процессора ткани для дегидратации и инфильтрации с воском обычно приводит к более высокой воспроизводимостью с точки зрения сохранения качества РНК и морфологии тканей. Альтернативная стратегия встраивания ткани в смолу также успешно используется для анализа типа специфических клеточных LAM 8. Тем не менее, использование автомПроцессор ткани ованные для встраивания в воске очень много времени эффективным, так как многие образцы могут быть обработаны сразу же требует как минимум практического времени. В то время как, как правило, нет значительной потери качества РНК происходит во время фиксации и встраивание, приготовление тонких срезов с микротома и, в частности, монтаж на frameslides, используемых для LAM остается важным шагом для сохранения качества РНК. Это ранее было отмечено , и использование системы передачи ленты была описана в более высокое качество РНК на данном этапе 12. Тем не менее, это добавляет еще один шаг больших затрат времени при подготовке слайдов, а также требует специального оборудования. Оптимизированный протокол , описанный ниже воспроизводимо производит РНК , которая обладает достаточным качеством для транскрипционного профилирования с GeneChips и следующего поколения секвенирования (NGS) подходы 7,11,13,14. Кроме того, с помощью лазерного микроскопа микродиссекции, используемого, высокая чистота выделенных типов клеток является беспорядочное бегствоinely производства 7,11,13,14.
Род Boechera является отличной моделью системы для изучения ключевых шагов апомиктическому воспроизводства. В Boechera, множество различных сексуальных и апомиктических присоединений были идентифицированы и могут быть использованы для сравнительного анализа 15,16,17. При сравнении типа клеток специфических Транскриптом клеток из женских зародышевых от сексуальных Arabidopsis и апомиктическому Boechera, мы идентифицировали гены и пути , которые дифференцированно выражены, выявляя тем самым новые аспекты регуляторных процессов , определяющих апомиксис 7. Кроме того, это исследование проверяется пригодность LAM для транскрипции типоспецифичной клеток анализ малых и редких типов клеток. Мы уже использовали этот протокол для анализа различных типов клеток в различных видов растений, но видо- и ткане-специфические модификации протокола может потребоваться в некоторых случаях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол подходит для различных мобильных и типов тканей
LAM в сочетании с транскриптом анализа с помощью микрочипов или РНК-Seq является ценным инструментом , чтобы получить представление о специфических форм активности генов , регулирующих развитие организма ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
