Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
Doku seviyesinde yapılan transkripsiyon çalışmalarda, son derece özel ama nadir hücre tiplerinin transcriptomes genellikle daha bol çevreleyen hücreler tarafından maskelenir. Bu son derece özel hücre tipleri için bir örnek, bitkilerde dişi üreme soy (tohum çizgisi) hücreleri bulunmaktadır. Kadın germ çiçek 1,2 dişi organ içinde, gelişmekte olan Yumurtacığa içinde tohum öncülerini belirtildi. megaspor anne hücre (MMC) kadın germline ilk hücresidir. Bu düşük megasporların bir tetrad oluşturulması için mayoz maruz kalır. Bir Sinsityum içinde, yani Tipik olarak, bu megasporların sadece biri hayatta ve sitokinez olmadan mitotik böler. Üç zıtlar iki synergid hücreleri, yumurta ve merkezi hücre: Bu mitoz tipik olarak dört hücre tipleri oluşur olgun gametofit oluşturmak üzere Hücreselleştirmeden tarafından takip edilmektedir. Yumurta ve merkezi hücreler dou sırasında iki sperm hücreleri tarafından döllenir olsun dişi gametlerin vardırble gübreleme gelişmekte tohum 1,2 embriyo ve endosperm yol vermek. 80 tohumlar yakından ilgili cinsi Boechera içinde çiçek başına geliştirmek – yaklaşık 50 iken cinsel model sistem Arabidopsis thaliana olarak, sadece ~ 50 tohum çiçek başına gelişir. Bu nedenle, kadın germ böyle hücre özellikleri ve farklılaşma gibi gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model yapma, sadece birkaç derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur.
Ayrıca, bitki üreme yöneten gen düzenleyici süreçlerine anlayışlar uygulamalı bir değer olabilir. Bitkilerde, tohumlar (Apomiksisin) aracılığıyla hem cinsel ve eşeysiz üreme oluşabilir. eşeyli üreme popülasyondaki genetik çeşitliliği oluşturur iken, anne bitki genetik olarak özdeş olan klonal yavrular oluşmasına yol açar apomiksis. Bu nedenle, apomiksis bile karmaşık anne genotipler can, tarım ve tohum üretimi uygulamaları için büyük bir potansiyele sahiptirbirkaç kuşak 3,4,5 üzerinde değişmeden muhafaza edilmesi. Apomiksis doğal olarak herhangi bir önemli bitki türlerinde oluşmaz, çünkü ürünlerde Apomiksisin mühendislik büyük ilgi 3,4,5 taşımaktadır. Ancak, bu uzun vadeli bir hedef Apomiksisin altta yatan genetik ve moleküler temeli yeterli detayda 6 anlaşılır değildir, çünkü elde etmek zordur.
Lazer yardımlı mikrodiseksiyon (LAM) ve yeni nesil dizileme (NGS) kullanarak apomiktik üreme, hücre tipine spesifik transkripsiyonel profilleme düzenleyen transkripsiyon bazda içgörüler kazanmak için çok güçlü bir yaklaşım 7,8 temsil etmektedir. LAM ilk hayvan ve biyomedikal araştırmalar için kurulmuştur. Son birkaç yıl içinde LAM bitki biyolojisi 6,9,10 uygulanmıştır. Tek tek hücre ve doku tiplerinin profil sağlayan diğer yöntemlerin aksine, LAM markör hatları 6,9,10 üretilmesini gerektirmez. Bu nedenle, uygulama olabilirönceden moleküler bilgisi olmadan herhangi bir hücre veya doku tipine yalan. LAM diğer bir avantajı, hücre konumu ve / veya yapısal özelliklerine göre, kuru bölümlerde kabul edilebilir gibi sürece, herhangi bir hücre tipinde uygulanabilir olmasıdır. LAM işlem esnasında transkripsiyonel profili değişiklikleri önler sabit dokular kullanılan ek bir avantaja sahiptir.
Çevrede, örneğin, çiçek dokusu dokusu, önceden parafın balmumu içine yerleştirilmeden olmayan bir çapraz bağlama sabitleyici sabitlenmiştir. Parafin gömme kurulan protokolleri 9,11 aşağıdaki elle yapılabilir. Ancak, balmumu ile dehidratasyon ve infiltrasyon için otomatik doku işlemci kullanımı genellikle RNA kalitesi ve doku morfolojisi korunması açısından yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır. Reçine dokuların gömme alternatif strateji de başarılı bir LAM 8 hücre tip spesifik analizler için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bir autom kullanımıBirçok örnekleri kez zamanında eller en az gerektiren işlenebilir olarak mum gömmek için ated doku işlemci, çok zaman etkilidir. RNA kalitesi, tipik olarak önemli bir kayıp tespit ve gömme sırasında ortaya birlikte, mikrotom ile kesitlerin hazırlanması ve özellikle LAM kullanılan frameslides montaj RNA kalitesinin korunması için kritik bir aşama olarak kalır. Bu, daha önce not edilmiştir ve bir bant transfer sisteminin kullanımı, bu aşamada 12, daha iyi bir RNA kalitesi elde etmek tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu preparatların hazırlanması sırasında ilave bir zaman alan bir adım ekler ve özel ekipman gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan optimize edilmiş protokol tekrarlanabilir GeneCHIPs ve Yeni Nesil Dizi (NGS) 7,11,13,14 yaklaşımları ile transkripsiyonel profilleme için yeterli kalitede RNA üretir. Buna ek olarak, kullanılan lazer mikrodiseksiyon mikroskobu ile izole edilmiş, hücre tipleri, yüksek saflıkta yatağından olaninely 7,11,13,14 üretti.
Cins Boechera apomiktik üreme kilit adımları incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Boechera, farklı cinsel ve apomiktik katılımların çeşitli tanımlanmıştır ve Karşılaştırmalı için kullanılabilir 15,16,17 analiz eder. Cinsel Arabidopsis ve apomiktik Boechera Kadın germline hücrelerin hücre tipine spesifik transcriptomes bir karşılaştırma olarak, bu şekilde 7 apomiksis yöneten düzenleyici süreçlerin yeni yönlerini tanımlayan farklı şekilde ifade edilen genleri ve yolların tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışma hücre tipine spesifik transkripsiyonel Lam uygunluğunu küçük ve nadir hücre tiplerinin analizi sunmaktadır. Daha önce bitki türlerinin çeşitli farklı hücre tiplerinin analizi için bu protokol kullanılır, ancak türlerin ve protokole dokuya özel modifikasyonları, bazı durumlarda gerekli olabilir var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol Farklı Hücre ve Doku tipleri için uygundur
Transcriptome ile kombine LAM mikroarrayler veya analizleri RNA-Seq gelişimsel ya da fizyolojik süreçleri 7-11,13,14 düzenleyen gen aktivitesinin spesifik kalıpları içine anlayışlar kazanmak için değerli bir araçtır. Ancak, herhangi bir belirli hücre tipi için bu yöntemin uygunluğu, yapısal konular kritik olarak bağlıdır. Hücre açıkça görülebilir ve LAM için kullanılan kuru bölüm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
