assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
Em estudos de transcrição feito ao nível dos tecidos, os transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, mas raros são muitas vezes mascarados pelas células vizinhas mais abundantes. Um exemplo para tais tipos de células altamente especializadas são as células da linhagem reprodutor feminino (linha germinal) em plantas. A linha germinal feminina é especificada dentro de óvulos em desenvolvimento, os precursores de sementes no interior do gineceu do 1,2 flor. O saco embrionário (MMC), é a primeira célula da linha germinativa feminina. Ele sofre meiose para formar uma tétrade de megásporos reduzidos. Tipicamente, apenas uma destas megásporos sobrevive e divide mitoticamente sem citocinese, ou seja, em um sincício. Estes são seguidos por mitoses celularização para formar o gametófito madura, que, tipicamente, consiste em quatro tipos de células: três antípodas, duas células synergid, o ovo, e a célula central. Os óvulos e centrais são os gametas femininos que são fecundados por dois espermatozóides durante doufertilização vel para dar origem ao embrião e do endosperma da semente em desenvolvimento 1,2. No sistema modelo de Arabidopsis thaliana sexual, apenas ~ 50 sementes se desenvolvem por flor, enquanto cerca de 50-80 sementes se desenvolvem por flor no género intimamente relacionado Boechera. Assim, a linha germinativa feminina consiste de apenas alguns tipos de células altamente especializadas, tornando-a um excelente modelo para estudar processos de desenvolvimento, tais como a especificação e diferenciação celular.
Além disso, insights sobre os processos de regulação de genes que regulam a reprodução de plantas pode ser de valor aplicada. Nas plantas, tanto a reprodução sexuada e assexuada através de sementes (apomixia) pode ocorrer. Enquanto a reprodução sexual gera diversidade genética numa população, apomixia, conduz à formação de prole clonal que é geneticamente idênticas à planta mãe. Portanto, apomixia tem um grande potencial para aplicações na agricultura e produção de sementes, como genótipos maternos mesmo complexo podeser mantido inalterado ao longo de várias gerações 3,4,5. Porque apomixia não ocorrem naturalmente em qualquer um dos principais espécies cultivadas, a engenharia de apomixia em culturas é de grande interesse 3,4,5. No entanto, este objectivo a longo prazo é difícil de conseguir porque a base genética e molecular subjacente de apomixia não é entendida em detalhe suficiente 6.
Para obter insights sobre a base de transcrição que regulam a reprodução apomítica, de tipo específico de células de perfil transcricional usando microdissection assistida por laser (LAM) e ao lado sequenciamento geração (NGS) representa uma abordagem muito poderosa 7,8. LAM foi estabelecido pela primeira vez em animais e investigação biomédica. Nos últimos anos LAM também tem sido aplicada a biologia da planta 6,9,10. Em contraste com outros métodos que permitem a criação de perfil de tipos de células e tecidos individuais, LAM não requer a geração de linhas marcadoras 6,9,10. Portanto, ele pode ser appmentiu para qualquer tipo de célula ou tecido sem o conhecimento molecular antes. Outra vantagem da LAM é que ele pode ser aplicado a qualquer tipo de célula, desde que a célula pode ser reconhecido nas secções a seco com base na posição e / ou características estruturais. LAM tem a vantagem adicional de que os tecidos fixos são usados, o que impede que as alterações do perfil da transcrição durante o processamento.
O tecido de interesse, por exemplo, tecido floral, é fixado num fixador não reticulado antes da inclusão em parafina. Incorporação em cera de parafina pode ser feito manualmente, seguindo protocolos estabelecidos 9,11. No entanto, a utilização de um processador automatizado de tecidos para a desidratação e infiltração com a cera resulta geralmente em maior reprodutibilidade em termos da conservação da qualidade do ARN e morfologia do tecido. A estratégia alternativa de incorporação de tecidos em resina também foi usada com sucesso para análises específicas do tipo de células por LAM 8. No entanto, a utilização de um automprocessador de tecidos ated para a incorporação em cera é muito tempo eficiente, como muitas amostras podem ser processadas ao mesmo tempo que exige um mínimo de mãos no tempo. Enquanto tipicamente sem perda significativa de qualidade de ARN ocorre durante a fixação e a incorporação, a preparação de secções finas com o micrótomo e, em particular, a montagem nas frameslides utilizados para LAM continua a ser um passo crítico para a conservação da qualidade do ARN. Isto tem sido observado anteriormente e a utilização de um sistema de transferência de fita foi descrita para resultar em melhor qualidade de ARN nesta etapa 12. No entanto, esta acrescenta um passo adicional demorada durante a preparação das lâminas e também requer equipamento especial. O protocolo otimizado descrito abaixo reproducibly produz RNA que é de qualidade suficiente para o perfil transcricional com GeneCHIPs e Next Generation Sequencing (NGS) se aproxima 7,11,13,14. Além disso, com o microscópio microdissecação laser utilizado, um elevado grau de pureza dos tipos de células isoladas é derrotainely produzida 7,11,13,14.
O gênero Boechera é um excelente sistema modelo para estudar as principais etapas de reprodução apomítica. Em Boechera, uma variedade de diferentes acessos sexuais e apomíticas foram identificados e podem ser usados para comparar as 15,16,17. Numa comparação de transcriptomes específicos do tipo de célula de células da linha germinativa feminina de Arabidopsis sexual e apomítico Boechera, foram identificados genes e vias que são expressos diferencialmente, identificando assim novos aspectos dos processos de regulação que regula apomixis 7. Além disso, este estudo verificou a adequação de LAM para transcrição específicos do tipo de célula análises de tipos de células pequenas e raras. Já têm utilizado este protocolo para a análise de diferentes tipos de células numa variedade de espécies de plantas, mas de espécies de modificações e específicos de tecidos para o protocolo pode ser necessária em certos casos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo é adequado para celulares diferentes e tipos de tecidos
LAM combinado com transcriptoma analisa por microarrays ou RNA-Seq é uma ferramenta valiosa para obter insights sobre os padrões específicos de atividade dos genes que regulam os processos de desenvolvimento ou fisiológicos 7-11,13,14. No entanto, a adequação deste método para qualquer dado tipo de célula está criticamente dependente de problemas estruturais. A célula deve ser clarament…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
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