개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
조직 수준에서 수행 전사 연구에서 매우 전문화하지만 희귀 세포 유형의 전 사체는 종종 더 풍부 주변 세포에 의해 마스크된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포 유형에 대한 예는 식물에서 여성의 생식 계통 (생식 세포)의 세포이다. 여성 생식 계열은 꽃 1, 2의 gynoecium 내부 개발 난자 내 씨의 전구체를 지정합니다. megaspore 모 세포 (MMC)는 여성 생식계의 첫번째 셀이다. 그것은 감소 megaspores의 테트라을 형성하는 감수 분열을 거친다. syncytium에, 즉, 일반적으로 이러한 megaspores 중 하나만이 살아과 세포질 분열없이 mitotically 나눕니다. 세 antipodals 두 synergid 세포, 난자, 중앙 셀 : 유사 분열이 전형적으로는 네 종류의 세포로 구성된 성숙 배우체를 형성 cellularization 뒤 따른다. 계란과 중앙 세포는 DOU 동안 두 개의 정자 세포에 의해 수정 된 얻을 여성의 생식있다BLE 시비 현상 시드 1,2 배아 및 배유을 야기한다. 80 씨앗 밀접한 관련 속 Boechera에 꽃 당 개발 – 약 50 동안 성적 모델 시스템 애기 장대에서 만 ~ 50 씨앗은 꽃마다 개발한다. 따라서 암컷 생식선은 휴대 사양과 분화 발달 과정 등을 연구하는 우수한 모델을 만드는 몇 매우 특별한 종류의 세포로 구성된다.
또한, 식물의 재생을 지배하는 유전자 조절 과정에 대한 통찰력은 응용 가치가있을 수 있습니다. 식물, 씨앗 (무수정 생식)을 통해 모두 성적과 무성 생식가 발생할 수 있습니다. 유성 생식은 인구의 유전 적 다양성을 생성하는 동안, 어머니 공장에 유 전적으로 동일 클론 자손의 형성에 리드를 무수정 생식. 따라서, 무수정 생식은 복잡한 산모의 유전자형이 할 수있는, 농업과 종자 생산에 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가지고여러 세대 3,4,5를 통해 변경되지 않은 유지 될 수있다. 무수정 생식 자연스럽게 주요 작물에 발생하지 않기 때문에, 작물의 무수정 생식의 공학은 큰 관심의 3,4,5이다. 그러나, 이러한 장기 목표 무수정 생식의 근본적인 유전 및 분자 기초는 충분히 상세히 6에서 이해되지 않기 때문에 달성하기 어렵다.
레이저를 이용한 미세 절제 (LAM) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 apomictic 재생, 세포 유형 특정 전사 프로파일 링을 지배하는 전사 기준에 대한 통찰력을 확보하는 것은 매우 강력한 방법 7,8를 나타냅니다. LAM 먼저 동물과 생물 의학 연구를 위해 설립되었습니다. 지난 몇 년 동안 LAM은 식물학 6,9,10 적용되었다. 개별적인 세포 및 조직 유형의 프로파일을 허용하는 다른 방법들과 대조적으로, LAM 마커 라인 6,9,10의 생성을 필요로하지 않는다. 따라서, 애플리케이션이 될 수있다이전 분자 지식없이 세포 또는 조직 유형에 거짓말. LAM의 또 다른 장점은 셀이 위치 및 / 또는 구조적 특성에 기초하여 건조 부에서 인식 될 수있는 것이 긴 어떠한 세포 유형에 적용 할 수 있다는 것이다. LAM은 처리 중에 전사 프로파일의 변화를 방지 고정 조직을 사용하는 추가적인 장점을 갖는다.
관심, 예를 들어, 꽃 조직의 조직은, 이전에 파라핀 왁스에 매립 비 가교 고정액에 고정되어있다. 파라핀 왁스에 포함 설립 프로토콜 9,11 다음, 수동으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 왁스의 침투와 탈수를위한 자동 조직 프로세서의 사용은 일반적으로 RNA 품질 및 조직 형태의 보전의 관점에서 높은 재현성을 초래한다. 수지 조직을 포함하는 대안의 전략은 성공적 LAM 8 세포 유형 특정한 분석을 위해 사용되어왔다. 그러나, 자동 게이트의 사용많은 샘플 일단 시간의 실질적인 최소 요구 처리 될 수있는 왁스 매립 ated 조직 프로세서는 시간이 매우 효과적이다. RNA의 질 전형적으로 상당한 손실이 고정 및 매립시 발생하는 동안, 마이크로톰 얇은 부분의 제조 및 특히는 LAM에 사용 frameslides에 장착하면 RNA 품질의 보존을위한 중요한 단계 남아있다. 이는 앞서 언급 한 내용 및 테이프 이송 시스템의 이용이 단계 (12)에서 더 RNA 품질 결과를 설명 하였다. 그러나,이 슬라이드의 제조시 추가의 시간 소모적 인 단계를 추가하고 또한 특별한 장치를 필요로한다. 설명 최적화 된 프로토콜은 재현성 GeneCHIPs 및 차세대 시퀀싱 (NGS)이 7,11,13,14 접근과 전사 프로파일에 충분한 품질의 RNA를 생성합니다. 또한, 사용되는 레이저 미세 절제 현미경 단리 세포 유형의 고순도 ROUT은inely은 7,11,13,14을 생산했다.
속 Boechera는 apomictic 재생의 주요 단계를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. Boechera에서, 상이한 성적 apomictic 가입 나 다양한 식별되고, 비교에 사용될 수 15, 16, 17은 해석한다. 성적 애기 장대와 apomictic Boechera에서 여성의 배아에서 세포의 세포 유형 별 전 사체의 비교에서, 우리는 이에 7 무수정 생식에 적용되는 규제 프로세스의 새로운 측면을 식별 차별적으로 발현되는 유전자와 경로를 확인했다. 또한,이 연구는 세포 유형 특이 적 전사 대 LAM의 적합성 작은 희귀 세포 유형의 분석을 확인 하였다. 이미 식물 종의 다양한 상이한 세포 유형의 분석이 프로토콜을 사용하지만, 종 – 상기 프로토콜 조직 – 특이 적 변형은 특정한 경우에 요구 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
의정서는 다른 세포와 조직에 적합하다
사체와 함께 LAM은 마이크로 어레이 또는으로 분석 RNA-서열은 개발 또는 생리 학적 과정 7-11,13,14을 조절하는 유전자 활동의 특정 패턴에 대한 통찰력을 얻을 수있는 유용한 도구입니다. 그러나, 특정 세포 타입에 대해,이 방법의 적합성 구조적 문제에 비판적으로 의존한다. 셀은 명확하게 볼 수 있고 LAM에 사용되는 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
