Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células
Summary
Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.
Abstract
The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.
Introduction
En transcripcional estudios realizados a nivel tisular, la transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, pero raras son a menudo enmascarados por las células circundantes más abundantes. Un ejemplo de tales tipos de células altamente especializadas son las células del linaje reproductivo femenino (línea germinal) en las plantas. La línea germinal femenina se especifica dentro de óvulos en desarrollo, los precursores de las semillas en el interior del gineceo del 1,2 flor. La célula madre megaspora (MMC) es la primera célula de la línea germinal femenina. Se somete a la meiosis para formar una tétrada de megaesporas reducidos. Típicamente, sólo uno de estos megasporas sobrevive y divide mitóticamente sin citocinesis, es decir, en un sincitio. Estos son seguidos por mitosis cellularization para formar el gametofito maduro, que normalmente consiste en cuatro tipos de células: tres antípodas, dos células synergid, el huevo, y la célula central. Los óvulos y centrales son los gametos femeninos que consiguen fertilizados por dos espermatozoides durante Doula fertilización ble para dar lugar al embrión y el endospermo de la semilla en desarrollo 1,2. En el sistema modelo Arabidopsis thaliana sexual, sólo ~ 50 semillas se desarrollan por flor, mientras que alrededor de 50 – 80 semillas por flor se desarrollan en el género estrechamente relacionado Boechera. Por lo tanto, la línea germinal femenina consta de sólo unos pocos tipos de células altamente especializadas, por lo que es un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo, tales como la especificación y diferenciación celular.
Por otra parte, una visión de los procesos de regulación de genes que regulan la reproducción de plantas pueden ser de valor aplicada. En las plantas, puede ocurrir tanto en la reproducción sexual y asexual a través de semillas (apomixis). Mientras que la reproducción sexual genera diversidad genética en una población, la apomixis conduce a la formación de la progenie clonal que es genéticamente idéntico a la planta madre. Por lo tanto, la apomixis tiene un gran potencial para aplicaciones en la agricultura y la producción de semillas, como los genotipos maternos incluso complejos puedenmantenerse inalterada durante varias generaciones 3,4,5. Debido a que la apomixis no se produce de forma natural en cualquier especie vegetal importante, la ingeniería de la apomixis en los cultivos es de gran interés 3,4,5. Sin embargo, este objetivo a largo plazo es difícil de lograr debido a que la base genética y molecular subyacente de la apomixis no se entiende con el suficiente detalle 6.
Para hacerse una idea de la base de la transcripción que regulan la reproducción apomictic, específica del tipo celular transcripcional de perfiles mediante microdisección asistida por láser (LAM) y la secuenciación de próxima generación (NGS) representa un enfoque muy potente 7,8. LAM primera se ha establecido para los animales y la investigación biomédica. En los últimos años LAM también se ha aplicado a la biología vegetal 6,9,10. En contraste con otros métodos que permiten perfiles de tipos de células y tejidos individuales, LAM no requiere la generación de líneas de marcador 6,9,10. Por lo tanto, puede ser la aplicaciónmentido a cualquier tipo de célula o tejido sin conocimiento previo molecular. Otra ventaja de LAM es que se puede aplicar a cualquier tipo de célula, siempre que la célula se puede reconocer en las secciones secas basada en la posición y / o características estructurales. LAM tiene la ventaja adicional de que se utilizan tejidos fijados, lo que impide cambios del perfil transcripcional durante el procesamiento.
El tejido de interés, por ejemplo, tejido floral, se fija en un fijador no reticulante antes de la incrustación en cera de parafina. Incrustación en cera de parafina se puede hacer manualmente, siguiendo los protocolos establecidos 9,11. Sin embargo, el uso de un procesador de tejido automatizado para la deshidratación y la infiltración con la cera generalmente da como resultado una mayor reproducibilidad en términos de la conservación de la calidad del ARN y la morfología del tejido. La estrategia alternativa de la incrustación de tejidos en resina también se ha utilizado con éxito para el análisis de tipos específicos de células por LAM 8. Sin embargo, el uso de un automprocesador de tejidos ado para incrustar en cera es muy eficiente en el tiempo, ya que muchas muestras se pueden procesar a la vez que requiere un mínimo de manos a tiempo. Aunque normalmente no hay pérdida significativa de la calidad del ARN se produce durante la fijación y la incrustación, la preparación de secciones delgadas con el microtomo y, en particular, el montaje en los frameslides utilizados para LAM sigue siendo un paso crítico para la conservación de la calidad del ARN. Esta ha sido previamente señalado y el uso de un sistema de transferencia de la cinta se ha descrito para dar lugar a una mejor calidad de RNA en este paso 12. Sin embargo, esto añade una etapa que consume tiempo adicional durante la preparación de los portaobjetos y también requiere un equipo especial. El protocolo optimizado se describe a continuación de forma reproducible produce ARN que es de calidad suficiente para el perfil transcripcional con GeneChips y Next Generation Sequencing (NGS) se acerca 7,11,13,14. Además, con el microscopio de microdisección láser utilizado, una alta pureza de los tipos de células aisladas es goleadainely produjo 7,11,13,14.
El género Boechera es un excelente sistema modelo para el estudio de los pasos clave de la reproducción apomictic. En Boechera, una variedad de diferentes adhesiones sexuales y apomícticas han sido identificados y se puede utilizar para los análisis comparativos 15,16,17. En una comparación de transcriptomes tipo de células específicas de las células de la línea germinal femenina de Arabidopsis sexual y apomictic Boechera, hemos identificado los genes y las vías que son expresados diferencialmente, identificando de este modo nuevos aspectos de los procesos de regulación que rige la apomixis 7. Además, este estudio verificó la idoneidad de LAM para la célula de la transcripción de tipo análisis específicos de tipos de células pequeñas y raras. Ya hemos utilizado este protocolo para el análisis de los diferentes tipos de células en una variedad de especies de plantas, pero en las especies y las modificaciones específicas de tejido en el protocolo pueden ser necesarios en algunos casos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El Protocolo es adecuado para diferentes tipos de células y de tejidos
LAM combinado con análisis del transcriptoma mediante microarrays o ARN-Sec es una valiosa herramienta para obtener información sobre los patrones específicos de actividad de los genes que regulan los procesos de desarrollo o fisiológicas 7-11,13,14. Sin embargo, la idoneidad de este método para cualquier tipo de célula dada depende críticamente de las cuestiones estructurales. La célu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG´s laboratory is supported by the University of Zürich, by a fellowship of the “Deutsche Forschungsgemeinschaft” and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the “Staatssekretariat für Bildung und Forschung” in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).
Materials
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1,4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devises are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. . An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis – the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. . Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).
