Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

העיצוב והפיתוח של assay colorimetric nanoparticle aptamer-זהב לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. בנוסף, יישום colorimetric חכם-התקן (אפליקציה) קיבלה תוקף ו אחסון לטווח ארוך של assay הוקמה לשימוש בתחום.

Abstract

העיצוב והפיתוח של ננו-חלקיקים aptamer-זהב (AuNP) assay colorimetric לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. יעד מבחני צבע סלקטיבי מבוסס AuNP פותחו הגדרות במעבדה הוכחה של קונספט מבוקר. עם זאת, תוכניות אלה לא הופעלו עד לנקודה של אי לקבוע השימוש המעשי שלהם מעבר להגדרות מעבדה. עבודה זו מתארת ​​גישה גנריות כדי לתכנן, לפתח, ולפתור ב assay colorimetric aptamer-AuNP עבור analytes מולקולה קטנה באמצעות assay עבור in-the-שדה הגדרות. Assay הוא יתרון משום aptamers adsorbed passivate משטחים ננו-חלקיקים ולספק אמצעי לצמצם ולמנוע תגובות חיוביות כוזבות analytes היעד הלא. מעבר למערכת זו שימושים מעשיים הנדרשת בהגדרה לא רק את חיי המדף של assay aptamer-AuNP, אלא מאשש שיטות ונהלים להארכת capabil האחסון לטווח הארוךities. כמו כן, אחת הדאגות מוכרת עם ההודעה colorimetric הוא את הנטל שהועמס על אנליסטים לזהות במדויק לעתים קרובות שינויים קלים בצבע. כדי להפחית את האחריות על אנליסטים בתחום, פרוטוקול ניתוח צבע נועד למלא את תפקידי זיהוי צבע ללא צורך בביצוע משימה זו על ציוד מעבדה כיתה. השיטה ליצירה ובדיקת פרוטוקול ניתוח נתונים מתוארת. עם זאת להבין ולהשפיע על העיצוב של מבחני aptamer adsorbed, האינטראקציות קשורות aptamer, היעד, ואת AuNPs דורשת מחקר נוסף. הידע שנצבר יכול להוביל תפירת aptamers עבור פונקציונליות משופרת.

Introduction

Colorimetry הוא אחת הטכניקות העתיקות ביותר בשימוש בכימיה אנליטית. עבור טכניקה זו, קביעה איכותית או כמותית של אנליטי שתעלה בהתבסס על ייצור של תרכובת בצבע 1. בדרך כלל, מבחני צבע להשתמש ריאגנטים כי לחוות שינוי צבע בנוכחות של מיני אנליטי, שתוצאתה שינוי צבע נצפה או לגילוי בספקטרום האור הנראה. Colorimetry נעשה שימוש זיהוי של מטרות, החל אטומים, יונים, ומולקולות קטנות למולקולות ביולוגיות מורכבות כגון חומצות deoxyribonucleic (DNA), פפטידים, חלבונים 2-4. במשך שני העשורים האחרונים, ננו חולל מהפכה בתחום מבחני איתור, במיוחד עם מבחנים מבוססים צבע 5-6. שילוב התכונות הכימיות ופיסיקליות הייחודיות של ננו עם אלמנט הכרת סלקטיבית היעד, כגון נוגדנים, aptamers oligonucleotide או aptamers פפטיד, הוביל אל תחייתה in בתכנון ופיתוח של מבחני זיהוי colorimetric 7.

חלקיקי מתכת יש נכס שינוי צבע גודל תלוי הפגין, אשר נוצל בעיצוב של מבחני colorimetric רבים. חלקיקי זהב (AuNPs) הם בעלי עניין מיוחד בשל שינוי צבע אדום-אל-כחול ייחודי, כאשר הפתרון של חלקיקים מפוזרים מושרה כדי לצבור 8, בדרך כלל באמצעות תוספת מדויקת של מלח. היכולת לשלוט על המעבר מן התפזר (אדום) אל המדינות המצטברות (הכחולה) הובילה ליצירת חיישני colorimetric עבור יוניים, קטן מולקולרי, פפטיד, חלבון, ומטרות הסלולר 2-4,9. רבים של חיישנים אלה להעסיק aptamers כמוטיב זיהוי מטרות.

Aptamers הוא DNA או חומצה ריבונוקלאית (RNA) מולקולות שנבחר מתוך מאגר אקראי של 10 12 -10 15 רצפים שונים 10-11. תהליך הבחירה מזהה מחדש יעדאלמנטים קוגניציה עם זיקות מחייבות במשטר nanomolar הנמוך, ואת האבולוציה השיטתית של ligands על ידי עשרת מעריכים (Selex) הוא התהליך ביותר הידוע בכינויו 12-13. יתרונותיו של aptamers המבוסס oligonucleotide עבור יישומי חישה כוללים וקלות הסינתזה, שינוי כימי לשליטה, ואת יציבות כימית 14-15.

גישה אחת יצירת assay colorimetric משלבת ננו עם אלמנטי הכרה, מורכב משלב שני המינים הללו באמצעות הספיחה הפיסית של מולקולות aptamer-DNA למשטחי AuNP. דרך-aptamer היעד מחייב, aptamer חווה שינוי מבני 16-18, שמשנה את האינטראקציה של aptamer עם המשטח AuNP, מה שמוביל בתגובה צבע אדום-אל-כחול מושרה 19 בתוספת מלח. תכונה מדהימה זו של AuNPs מספקת מנגנון תגובה colorimetric הנצפה למכשירים מבוססי aptamer שניתן להשתמש לדהלחתום מבחני colorimetric עבור analytes שונים.

מבחני צבע המעוצבים באמצעות הלא קוולנטיים, aptamers DNA adsorbed פיזית על משטחי AuNP יש את הסטיגמה של להיות פלטפורמת חיישן חלשה עקב בעיות עם איתנות, נטייה לכישלון מחוץ הגדרות מעבדה מבוקרות, וחוסר המידע הזמין לשימוש מעשי הגדרות. עם זאת, assay colorimetric מבוסס aptamer-AuNP היה עניין בגלל הפשטות של פעולה ותגובה צבע הנצפה. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול בתכנון, פיתוח, תפעול, צמצום השטח הקשורים תשובה חיובית כוזבת, אחסון לטווח ארוך של מבחני colorimetric מבוסס DNA-AuNP באמצעות קוקאין כמו אנליטי נציג. יתר על כן, הצענו גישה assay aptamer adsorbed זו (איור 1) כמו להיות יתרון בשל הפשטות וקלות השימוש שכתוצאה ממנה בפחות שלבים מאשר הגישה המקובלת עבור התחת אלה aptamer-AuNPays. עבור assay זה, aptamer נוספה לראשונה AuNPs, אשר הורשו לספוג אל פני השטח במשך תקופה ארוכה של זמן. יתרון נוסף לגישה זו היה צמצום בתגובה מולקולות אנליטי יעד שאינו קשור אינטראקציות פני AuNP. עם זאת, הירידה בתגובה חיובית כוזבת הייתה על חשבון רגישות assay. לכן איזון בין הגנת משטח ונגישות אנליטי יש צורך לשמור על תפקוד נאה assay. יתר על כן, פגם עמוק ועיקרי של ניתוח מבחני צבע באמצעים אחר מלבד עם המכשור הוא כי התוצאות הן בדרך כלל סובייקטיבי פתוחים לפרשנות אנליסט אל אנליסט, במיוחד כאשר מנסים לבדל הבדלים דקים בצבע. לעומת זאת, ישנם מספר נושאים עם קבלת במכשור מעבדה מבוסס שמיש מחוץ למעבדה, כגון זמינות של כוח, פרקטיות עם ניידות, וכו 'בעבודה זו, פרוטוקול ניתוח צבע פותחה עבור מורדואר ניידות לבטל חלק את הניחושים נפוצים הקשורים פרשנות assay מבוסס צבע 20-21. בהשוואה לגישות קודמות, המאמץ הזה שאף לדחוף מבחנים אלה עד קצה גבול היכולת שלהם עבור יישומים מעבר הגדרות במעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה באמצעות הפחתת ציטראט של ננו-חלקיקי זהב (AuNP) ואפיון

  1. לניקוי בקבוק Erlenmeyer (500 מיליליטר) ו בר ומערבבים גדולים עם 5 מיליליטר מרוכז חומצה חנקתית 15 מיליליטר מרוכז חומצה הידרוכלורית במנדף בטיחות הכימי.
    1. להרטיב את פני השטח של הבקבוק עם לשטוף את החומצה, לשטוף את הבקבוק עם מים חינם nuclease, ולאפשר את הבקבוק להתייבש.
  2. הוספת 100 מ"ל של 1 זהב מ"מ (III) כלוריד; להשתמש בגיליון של נייר אלומיניום כדי לכסות את החלק העליון של הבקבוק וחום Erlenmeyer ניקה חומצה עם בחישה מתמדת על פלטה חשמלית עד רתיחה.
  3. הוסף 10 מ"ל של נתרן ציטרט 38.8 מ"מ. הצבע ישתנה מ / אפור בהיר, כחול, אדום / שחור כהה, ולבסוף כהה על פני כמה דקות. המשך ערבוב עם החום לסירוגין במשך 10 דקות.
  4. אפשר ההשעיה AuNP להתקרר לטמפרטורת החדר ומוסיפים 110 μl של diethylpyrocarbonate (DEPC) עם בחישה מתמדת.
  5. מכסים את הבקבוק כולו עםרדיד אלומיניום ולאפשר טיפול DEPC כדי לדגור לילה. אחסן את כל AuNPs בחושך, במיכלים אחסון ענבר או מכוסה בנייר אלומיניום.
  6. חיטוי השעית AuNP, להתקרר לטמפרטורת חדר, ולסנן דרך קרום יצטט תאית 0.22 מיקרומטר נקבוביים. אחסן את פתרון מניות AuNP המסונן, autoclaved בחושך ב 4 ° C..
    הערה: טיפול עם DEPC, עיקור באמצעות החיטוי, ואחסון ב 4 ° C ישפר את חיי המדף של assay aptamer-AuNP. חפצים באופן זה יאפשר עבור assay להישאר פונקציונלי במשך יותר מ 2 חודשים.
  7. חשב את הריכוז AuNP ידי קבלת הקליטה Ultra גלוי-ויולט ב 520 ננומטר, ולהשתמש מקדם הכחדה (Ɛ) 2.4 x 10 8 L mol -1 -1 ס"מ עם חוק של בירה לפי חישוב ריכוז (ג). הריכוז היה נחוש בדעתו להיות 10 ננומטר עם גודל של 15 ננומטר נקבע על ידי פיזור אור דינאמי.
    הערה: ריכוזים ישתנו frתצווה ל-תצווה אום. לדלל את מניות AuNP עם מים חינם nuclease ככל שיידרש כדי לשמור על ההשעיה הרצויה 10 ננומטר AuNP.

2.-aptamer DNA, מאגר, פתרון, והכנת Assay

  1. לרכוש או לסנתז את הקוק הבא מחייב רצפי aptamer באמצעות כימית phosphoramidite תקן 22:
    MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 "
    MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 "
  2. לטהר את aptamers באמצעות desalting תקן 23. לשקם oligonucleotides במים nuclease ללא משני 100 מיקרומטר או 1 פתרונות מניות מ"מ. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
  3. רכישה או להכין מלאי של מגנזיום כלוריד 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) pH 7.4, 100 מ"מ סטרילי (MgCl 2), ומלח 1 M (NaCl).
  4. הכן 50 מ"ל של חיץ wi nuclease ללא מיםריכוזי ה 20 HEPES מ"מ, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.4 וחנות בטמפרטורת החדר למשך חודשים.
  5. דגירה ה- DNA עם פתרון המניות AuNP (10 ננומטר) במשך 3-4 שעות בטמפרטורת החדר ולהגן מפני האור. שנו את עוצמת הקול של AuNPs כרצונך כדי לספק מדגם מספיק עבור הבדיקות שיש לבצע (2.5-7.5 מ"ל).
    1. הנה, להשתמש צפיפויות העמסת 90, 120, 150, ו -180 מולקולות DNA / AuNP בעבודה זו. שנו את נפח ריכוזי DNA בהתאם. כוון את כיסוי DNA כדי להפחית תגובות צבע מכוונות הקשורים AuNP שטח של analytes היעד הלא.
      הערה: הגדלת כיסוי DNA תפחית את רגישות assay. צפיפויות הטעינה מחושבות מלדעת את הריכוז של מניית AuNP, ואת חישוב המספר הכולל של AuNPs נוכח העצמה הרצוי לשימוש בניסויים. אם צפיפויות כיסוי בפועל הם רצויים, פרוטוקולים קיימים כדי להשיג אותם ערכי 7. כיסוי DNA נקבע באמצעות מ 50 kDaטור הפסקת ספין משקל olecular להפריד את ה- DNA המחויב AuNP מן DNA החופשי. AuNPs הם גדולים מדי כדי לעבור את הטור ספין, בעוד DNA חופשי יעבור בקלות. השלב הבא הוא לכמת את DNA החופשי שנאסף באמצעות מדידות ספיגות או פלורסנט לצבוע DNA גדילי יחיד.
  6. הוסף נפח שווה של 20 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.4 חיץ והמקום מדגם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה האפל. את assay aptamer-AuNP היה בתוך 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ MgCl 2, pH 7.4 (חיץ assay).

3. מלח טיטרציה והגדרת Assay

  1. קבע את ריכוז מלח הראשוני צריך לעורר תגובת צבע assay ידי טיטרציה מלח עם ריק assay. הוסף 20 μl של מתנול (ריק) 180 aliquots μl של assay aptamer-AuNP בצלחת 96-היטב. לכייל את הדגימות עם הגדלת כמויות של מניות פתרון NaCl (1 M או 2 M) וקבע את נקודת השקילות (איור 2 הערה: assay וניתן לשנותם לנפחים קטנים יותר על ידי שמירה על יחס של מתנול ריק (או אנליטי מומס) כדי aptamer-AuNP assay אותו.
    1. כאן, לקבוע את עוצמת קול NaCl הדרוש כדי לגרום שינוי צבע הקל שבקלים על ידי תצפית ויזואלית. ריכוז החל עבור assay היה 75 מ"מ ו -130 מ"מ עבור MN4 ו MN6, בהתאמה בצפיפות כיסוי מולקולה 60 DNA / AuNP.
      הערה: לשם קביעה כמותית של ריכוז המלח הראשוני, נקודת האמצע של עקומת טיטרציה משמשת כנקודת התחלה טובה. כמו כן, ריכוזי בשימוש תשתנה בהתאם על aptamer, צפיפויות כיסוי DNA, מהיום-יום הביצועים, אצווה ל-אצווה.
  2. אופטימיזציה של תגובת assay, להוסיף 20 μl של מולקולות אנליטי מדולל מתנול 180 aliquots μl של assay aptamer-AuNP בצלחת 96-גם בטמפרטורת החדר. מיד להוסיף ריכוז NaCl נקבע בשלב הקודם כדי ליזום את התגובה צבע assay.
    לאTE: לנצל טפטפת רב לבצע ניסויים מרובים בו זמנית.
  3. השג את שינוי הצבע הגדול ביותר האפשרי על ידי הגדלה או הקטנת ריכוז NaCl, ומשווה את היעד לתגובה לתגובה הריקה. השתמש ריכוז NaCl המספק את ההבדל בתגובה הגדול.
  4. ציית או למדוד את שניות assay בתגובה 150 הבאות בנוסף NaCl. לנתח את הספיגה ב 650 ננומטר ו 530 ננומטר באמצעות ספקטרומטר או לקבל תמונת מצלמה דיגיטלית של תגובת assay (ראה סעיף 4 לפרוטוקול ניתוח התמונה).
    הערה: קורא microplate שימש בהשגת מדידות עבור עבודה זו.
  5. מגרש את התוצאות כיחס בין הספיגה מתקבלת על 650 ננומטר 530 ננומטר (E 650 / E 530) כפונקציה של ריכוז אנליטי. לנרמל את תגובת assay לאות הריק כפי שנעשה בעבודה זו.

4. תמונה תמונה דיגיטלית ניתוח פרוטוקול ניתוח צבע

  1. הכנהדואר דגימות assay כמתואר (סעיפים 3.2-3.3). מניחים את צלחת 96-היטב על transilluminator.
    הערה: transilluminator מעבדה סטנדרטי הוא בדרך כלל בהיר מדי כדי להשיג תמונות דיגיטליות שמישות עבור ניתוח זה. transilluminators אלה גורמים פזור "קווים כהים" להופיע בתמונה הדיגיטלית בשל עוצמת מקור האור. ביצוע transilluminator מ דיודה פולטת אור (LED) תיבת אור מבוססי חתיכת פלסטיק אטום עובד היטב.
  2. להשיג תמונות של הצלחת 96-היטב ב 150 שניות לאחר תוספת NaCl, לייבא את התמונות לתוך תוכנת ניתוח תמונה, ולחשב את הערכים אדומים, ירוק וכחול הממוצע (RGB), באמצעות טכניקת מיצוע מצטברת, כפי שמוצג במשוואה 1 24:
    (1) משוואה 1
  3. המר את ערכי RGB מ- RGB תקן מרחב הצבעים (sRGB) בתרשים chromaticity מרחב הצבעים (CIExyY), באמצעות המשוואות הבאות 24:
    (2) משוואה 2
    (3) משוואה 3
    (4) משוואה 4
  4. המר את ערכי RGB מעריכים לערכי RGB ליניארי באמצעות משוואה 2. מטריקס שצוין במשוואה 3 משמש כדי לחשב את X, ​​Y ו- Z ערכים של מרחב צבע CIE 24.
  5. חשב את ערכי צבע x ו- y בעזרת משוואה 4 המייצג את הצבע הממוצע של הפיקסלים באזור שנבחרו לניתוח 24.
  6. לבצע את הניתוח בכל היטב עלילת ערכי הצבע כדי ליצור עקומת כיול (איור 4). השג את סטיית התקן על ידי ניתוח צבע של אזורים שונים של אותו היטב.

5. הקפאה Assay Aptamer-AuNP עבור אחסון לטווח ארוך

  1. הכן את רכיבי assay-AuNP aptamer כמפורט בסעיפים 2.4 ו -2.5. הפוך פתרונות נפרד המכיל trehalose 1 גרם / מ"ל ​​ו -1 גרם / מ"ל ​​סוכרוז במים nuclease ללא להפוך את פתרון cryogen.
    הערה: ריכוזים גבוהים של trehalose וסוכרוז שימשו כדי להפחית את גורם לדילול בעת עריכת assay להקפאה. מחממי הפתרונים הסוכרים על פלטה חשמלית בתוך כוס של מים כדי לפזר את הסוכרים לפני השימוש ביסודיות.
  2. בצע פתרון המכיל 19.2 מ"ג / מ"ל ​​trehalose ו -4.8 מ"ג / מ"ל ​​סוכרוז עם 60 assay MN4-DNA / AuNP בווליום סופי של 200 μl ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. ריכוזי פתרון cryogen סופיים ישתנו עם כיסוי DNA.
    הערה: דוגמאות להיות קפוא לא יעלה על 300 μl. גדול כרכים לא יכול להקפיא כראוי.
  3. פלאש להקפיא את הדגימות באמצעות במקפיא C -146 ° או בחנקן נוזלי. אחסן את דגימות קפוא עד השימוש. אחסון יכול להיות -80 מעלות צלזיוס או -20 ° C ברגע פלאש ההקפאה הושלמה.
  4. עבור עבודה זו, השאר את הדגימות במקפיא C -146 ° מעללילה ולאחר מכן להעביר במקפיא -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: הקפאת פלאש יכול לגרום aptamer-AuNPs לצבור. בדוק את תקינותו של תהליך ההקפאה על ידי ניטור הפרופיל הספיג והשוואתו מדגם מהקפאה. אם הצבירה הוא ציין, להגדיל את כמות פתרון cryogen כדי לפצות על בעיה זו.
  5. הפשרת הדגימות בטמפרטורת חדר ולהשתמש רק דגימות מספיק לפי צורך לניסויים. השג ספקטרום ספיג של דגימות מופשרות להשוות את ספקטרום הבסיס של מדגם מטופלי פתרון cryogen מהקפאה. מדוד את הספיגה מ 400 ננומטר עד 700 ננומטר.
  6. בצע את טיטרציה המלח (סעיף 3.1), לבדוק את assay (סעיף 3.2), ואת עלילת התוצאות (סעיפים 3.3 ו -3.4) כפי שתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הייתה לפתח ולחקור את יציבותה וחוסנה של aptamer מבוסס מבחני colorimetric AuNP לשימוש בתחום. מודגש כמו בפרסום קודם, שתי אסטרטגיות ברורות ליצירת assay נחקרו 7. המבחנים וכונו את assay Aptamer חינם ואת Assay Aptamer adsorbed. את assay Aptamer adsorbed היה יותר מושך למטרות של assay זיהוי fieldable (איור 1).

איור 1
. באיור 1. ייצוג סכמטי של Assay Aptamer adsorbed aptamer נמהלה AuNPs וטופחו לילה; מולקולות אנליטי מומסות מתנול נוספו Assay Aptamer השקוע, מייד ואחריו התוספת של נתרן כלורי (NaCl) כדי לגרום צבירת AuNP כאשר היעד נוסף.יעד EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זה היה בשל הפחתת שיעורי חיובי כוזב כדי analytes nontarget, הפשטות היחסית, וקלות השימוש של Assay Aptamer adsorbed. כדי להכין את Assay Aptamer adsorbed, את aptamer דנ"א נמהל AuNPs וטופח לילה למאגר assay. זה אפשר aptamer לספוג בקלות על פני שטח AuNP, אשר הקטין את הרגישות של assay לתגובות חיוביות כוזבות למולקולות אנליטי nontarget כגון מיסוך או חיתוך סוכנים. עם זאת, רק את מבנה preformed של aptamer קוקאין MN4 היה פעיל בנוכחות קוקאין (היעד) בעיצוב assay זה. את assay הועסק על ידי הוספת פתרונות אנליטי ואחריו תוספת מיידית של הריכוז המתאים של NaCl. פתרונות מלח שימשו ליזום את הנצפה ומאהשינוי צבע surable של assay. את assay הוצא להורג תוך 2-3 דקות. לאחר תוספת של הפתרון אנליטי.

פעולה קריטית בביצוע מבחני colorimetric המבוסס adsorbed הפיסית אלה DNA היא תגובת צבע מושרה, באמצעות התוספת של הריכוז המתאים של מלח. תוספת של מלחים ידועים לערער השעיות AuNP וכתוצאה מכך הצטברות של חלקיקים על ידי מסווה את המטענים השליליים של השכבה ציטראט כי לייצב את AuNPs, ולאחר מכן מפחית את אינטראקציות אלקטרוסטטיות interparticle. התוצאה היא שינוי צבע אדום-אל-כחול הנצפה. את אותו האפקט הוא ציין עם AuNPs שטופל DNA. במקרה של aptamers DNA, אנליסט לקביעת ריכוז מלח צורך לגרום יציבות AuNP נצפה מינימאלית (צבע כחול). עם תוספת של היעד, התייצבות AuNPs ידי aptamer-DNA מצטמצם משמעותית וכתוצאה מכך observable, שינוי צבע בתגובה מינון היעד למדידה. שינוי צבע זה יכול להיתפס רק עם תוספת של כמות המלח מראש המתאימה.

לא פחות חיוני הוא התהליך שבו הריכוז המתאים של מלח נקבע. הדבר זה הושג על ידי ביצוע עקום טיטרציה ידי הוספת ריכוזים גוברים של פתרון נתרן כלורי לסדרה של חסר assay (איור 2).

איור 2
איור 2. עקומת טיטרציה הנגרמת מלח. מיוצב ציטראט (אדום), MN4 קוקאין מחייב aptamer (ירוק), ו MN6 קוקאין aptamer מחייב (סגול) שטופלו דגימות AuNP היו טיטרציה עם נתרן כלורי (NaCl). ריכוזי המלח הראשוניים המתקבל חזותי צוינו עם מקביל חצים צבעוניים לכל עקומה. ברים שגיאה מוגדרים לפי סטיית התקן בעוֹתֶק מְשׁוּלָשׁ מדידות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כאן, ריכוז המלח הראשוני בשימוש נקבע על ידי בדיקה ויזואלית, ונלקח להיות ריכוז המלח שגרם צבע כחול השמץ נצפה עם ריק assay. אולם עבור גישה כמותית יותר, חוקרים חדשים על תחום המחקר יכול להשתמש נקודת האמצע של נקודת שקילות טיטרציה כמו ריכוז מלח החל. מעבר לנקודה זו תגובת הצבע מתחילה לעלות בקצב מהיר. זאת ועוד, לריכוז מלח המשמשת לביצוע assay הותאם על מנת למקסם את ההבדל בצבע בין התגובות הריקות וקוק assay. דבר זה הושג על ידי הגדלה או הקטנה ריכוז מלח מן הסכום שנקבע על ידי טיטרציה. הליך טיטרציה המלח בוצע יומידין וחשבון על השתנות היום-יום עם assay. השתנות אצווה בריכוז מלח הדרושים assay היה לא יותר מ 20%. יש איור 2 שלוש דגימות AuNP ברורים, התייצב-ציטראט (אין DNA), MN4 (DNA-aptamer התייצב), ו MN6 (DNA-aptamer התייצב). כיסוי DNA עבור דגימות MN4 ו MN6 היו 60 מולקולות DNA / AuNP, וכל עקומת טיטרציה יש נקודת שקילות טיטרציה שונה אמצע מבוסס על רמת היציבות שמספקת טיפול המשטח. ציטראט ספק מעט יציבות, MN4 (גדילים כפולים כמו מבנה) ספק יותר יציבות MN6 (גדילי יחיד כמו מבנה) ספק את היציבות ביותר AuNPs. ריכוזי המלח הראשוניים המשמשים בעבודה זו היו כל כך נחושים להיות ~ 50 מ"מימ, ~ 90 מ"מ, ו ~ 130 מ"מ חזותי. המגמה מסכים עם ההבנה המקובלת של מבנה דנ"א השפעה מייצבת על AuNPs 24-25. בעת ביצוע בדיקה זו חזותית, את חלל הריק assay הראה Colora הכחול קל tion עם ריכוזי המלח כפי שזוהה באיור 2 עם חצים, שהן קרובות האמצע כפי שפורט. הריכוזים המלחים לפני נקודות תזות לספק מעט או ללא שינוי צבע נצפה, ומעבר נקודות אלה עולים צבע במהירות. עבור עבודה זו, ריכוז המלח הראשוני נקבע ויזואלית ולאחר מכן מכויל באמצעות השוואות מדידת קורא microplate של דגימות ריקות וקוק assay.

עם התקרבות Assay Aptamer חינם, תגובות חיוביות כוזבות היו בעיה. אינטראקציות Surface של מולקולות אנליטי הן מקור אחד לבעיה זו, כמתואר בפרסום קודם 7. כדי למנוע את תגובות צבע המכוונות בשל אינטראקציות פני AuNP ספציפיים, צפיפות כיסוי DNA של aptamer מחייב היעד נשלטה (איור 3).

jpg "/>
איור 3. בתגובה assay adsorbed aptamer עם צפיפות כיסוי DNA שונים. בתגובה Aggregation לקוקאין (אדום, היעד), EME (ירוק, שליטה), ו פרוקאין (כחול), מולקולה פעילה משטח AuNP, עבור 90, 120, 150, ו -180 צפיפויות כיסוי DNA / AuNP הוצגו. כל הדגימות נותחו היו מומסים מתנול הוא 1 מ"ג / מ"ל. ברים שגיאה מוגדרים לפי סטיית התקן במדידות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

באופן כללי, שיעור התגובה החיובי הכוזב של מולקולות אנליטי nontarget בשל אינטראקציות AuNP הופחת עם הגדלת צפיפות כיסוי DNA. עם זאת, רגישות assay הופחתה כתוצאת כיסוי DNA גדל. בעבודה זו, צפיפויות DNA של 60, 90, 120, 150, 180, ו -300 DNA / AuNP investiga היוטד. צפיפויות של 60 ו -300 תוארו בהרחבה בעבודה קודמת 7. איור 3 מייצג צפיפויות DNA נוספים למדו. פרוקאין היה אחד analytes nontarget הפעיל פנים יותר ביותר שנסקר. עבור כל אחד מהכיסויים דנ"א הבודדים, תגובת assay הייתה מוגדלת על ידי התאמת ריכוז המלח כמתואר. באופן כללי ככל שעולה כיסוי DNA, ההבדל בתגובה בין השליטה (EME) ותגובת קוק פוחת. באופן דומה, תגובת assay בנוכחות פרוקאין יורדת לרמות רקע עם כיסויים גוברים. 180 DNA / המשטח בוטל צפיפות AuNP הקשורים תשובה חיובית כוזבת עבור פרוקאין, תוך שמירה על יעד לתגובה גבוהה. הערכה זו מתארת ​​תהליך עבור כוונון מבחני צבע אלה לצמצום תגובות חיוביות כוזבות הקשורות השטח, תוך שמירה על יעד לתגובה ככל האפשר. רגישויות משופרות יכולות להיות מושגת על ידי הקטנת כיסוי DNA. עם זאת, posi שוואתגובות מופרזות עלולות להיות בעיה בהתאם ליישום.

מבחני Colorimetric משמשים לבדיקות איכותיות מהירות, פשוט לעתים קרובות משוערות ואפילו כמותית. בעיות נפוצות עם קביעות colorimetric הן האופי הסובייקטיבי של הבחנת הצבע, במיוחד עם הבדלי צבע עדינים גבוליים. קריאות השיפוט אשר חייבת להתבצע על ידי האנליסט יכולות לגרום לפרשנות שגויה של הנתונים. מדידות על ציוד מעבדה להפחית את אי הוודאות וחוסר החלטיות הקשורים הערכת תוצאות assay. עם זאת בעבודה זו, הכוונה היתה לספק assay שדה מוכן שסיפק תוצאות מיידיות עם המטפל. ככזה, טכניקת ניתוח תמונת תמונה הוקמה שספקה מכך צבע החלטי יותר (איור 4).

איור 4
איור 4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עם ריכוזים גוברים של קוק, צבע assay ביאת צבע כחול גובר. תמונות דיגיטליות של עקומות כיול התקבלו באמצעות שני טלפונים חכמים שונים, ומיובא למחשב נייד רגיל לניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. ערכי chromaticity שמשו עלילת געקומות alibration כפי שמוצגות באיור 4. ניתוח התמונה ספק מענה ליניארי להגדלת ריכוז קוק עם שני הסטים של תמונות חכמות כפי שצוין על ידי 2 ערכי R. שיטה זו הועברה אל אפליקצית Smart-מכשיר כדי לסייע למטפל בתחום. הערכה מפורטת של היישום בוצעה בפרסום קודם 7. האפליקציה בוטלה הרבה חוסר הוודאות וחוסר ההחלטיות הקשורים תוצאות שינוי הצבע עדינות של ריכוזי הקוק הנמוכים ביותר.

האחסון לטווח ארוך של מבחני DNA adsorbed פיזית מסוג זה לא נחקר בפירוט רב אחת המטרות של עבודה זו הייתה למצוא תנאים להארכת חיי מדף assay. טיפול של רכיבי assay לאחסון ב 4 ° C היה מפורט בפרסום קודם 6. עבור עבודה זו, lyophilization של רכיבי assay המוכנים נחשב לשימוש לטווח ארוכים o האחסוןf assay. Lyophilizing הרכיבים assay יש את היתרון הברור של שמירה ואחסון דגימות בטמפרטורת הסביבה, אשר היה מונע את הצורך במקרר או במקפיא. השלב הראשוני בתהליך lyophilizing הוא ראשון להקפיא את המדגם. כדי לבדוק את דגימות AuNP לשרוד את תהליך ההקפאה, לבצע השוואה בין הספקטרום הספיג של assay לפני הקפאה לזה של המדגם המופשר. הסריקות צריכות להתאים בדיוק. אם הדגימות אינן שורדות את תהליך ההקפאה, ספקטרום המדגם המופשר יגבר ספיג באזור מעל 525 ננומטר. זה מצביע על כך AuNPs מצטבר במהלך הקפאה ואת המדגם המופשר נפגע. הכדאיות של assay המופשר נבדקת עם קוק EME (איור 5).

איור 5
איור 5. מחקר חיי המדף בתגובה adsorbed Assay Aptamer. Quantification של תגובת assay כדי EME (ירוק, שליטה), וקוק (אדום, יעד) הופיעה עם קפוא ולאחר מכן מופשר דגימות adsorbed Assay Aptamer במהלך תקופה של ארבעה שבועות. ברים שגיאה מוגדרים לפי סטיית התקן במדידות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הדגימות הריקות assay המופשר נשארות באותו הערך לאורך תקופת המחקר כפי דגימות שנעשו ומשומשים מייד (לא אחסון). התגובות של דגימות קוק EME תאמו תגובות טיפוסיות ציינו עם דגימות עשו ומשומשות מייד (לא אחסון). הדגימות הקפואות נוטרו לתקופה של 4 שבועות ללא שינוי לביצועי assay לעומת דגימות מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס לעומת התקופה המקבילה של זמן 7 או דגימות assay ושמשו immediately. תגובות קוק היו קבועות יחסית בתקופת 4 השבוע, אשר נצפתה גם עבור דגימות 4 ° C 7. הירידה אות EME משבוע 1 עד שבוע 2 הוא נצפה לעיתים קרובות עם בטמפרטורת החדר 4 ° C אחסון וכן. תופעה שייחסנו התבגרות של assay בשבוע הראשון. גישה זו augmented את האפשרויות הזמינות עבור אחסון לטווח ארוך של מבחני colorimetric DNA adsorbed, וסיפק שער לאפשרויות אחסון לטווח ארוך נוסף, כלומר lyophilization.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך העשור האחרון, מבחני colorimetric מבוסס ננו-חלקיקים פותחו לצורך זיהוי של מטרות כוללים מולקולות קטנות, DNA, חלבונים, תאים 2-4. מבחני המשתמשות DNA-aptamers עם חלקיקים כבר צובר ריבית. בדרך כלל, מבחני colorimetric אלה מבוצעים על ידי ערבוב-aptamer דנ"א עם מולקולות אנליטי ואחריו בנוסף AuNPs 9-10. עם זאת, מבחנים אלה נוצלו בהפגנות הוכחה של קונספט עם הגדרות מעבדה מבוקרות ועם בקרות מוגבלות, שנבחרו. הפיתוחים אחרונים מעבר הטכנולוגיה הזו לתחום נעשתה 7. בגישה זו, את aptamer DNA היה שנספחו AuNP משטחים לפני תוספת של מולקולות אנליטי להיבדק (איור 1). פיתוח מבחני colorimetric מבוסס ננו-חלקיקים או aptamer-זהב דורש אופטימיזציה בשלבים שונים של תהליך הייצור / ניתוח. לפיכך, אלה חדשים לדיסקipline חייב להיות מודע לניואנסים הקשורים זיקוק ופתרון בעיות אלה מבחנים כדי להצליח.

מבחני nanoparticle aptamer-זהב adsorbed לדרוש אופטימיזציה זהיר עבור כל זוג aptamer / היעד. עם זאת, ביצוע השלבים הסבירו כאן מציע פרוטוקול עקבי ביצוע אופטימיזציה של מבחני colorimetric אלה. הקביעה והכוונון של ריכוז המלח שתוצאתו שינוי הצבע הנצפה או למדידה המרבית בין ריק יעד assay הוא אחד הצעדים אופטימיזציה הקריטיים יותר (איורים 2 ו -3). עבור חלק מאנשי זוגות aptamer / יעד, יש לנו ציינו כי באמצעות ריכוזי מלח גבוהים ליד נקודת הסיום של עקומת טיטרציה גרמו שינוי צבע כחול-אל-אדום 18. דבר זה מצביע על התייצבות AuNPs ידי aptamer על התוספת של היעד והמלח.

גורמים נוספים שעשויים להשפיע על PE assayrformance כוללים רכיבים חיץ וריכוזי, סכום הכיסוי DNA-aptamer, ממסים בשימוש, טמפרטורה, רצף aptamer ומבנה, זמן הדגירה היעד-assay (הזמן שבו היעד מתווסף assay, לפני תוספת מלח), וזמן הפיתוח צבע ( הזמן דרוש הצבע לפתח, לאחר תוספת מלח). 10 מ"מ HEPES, 1 מ"מ MgCl 2 pH 7.4 חיץ היה חיץ assay הבחירה ברבים זוגות היעד / aptamer המשמשים בעבודה שלנו. עם זאת, החיץ הזה לא יכול להיות אידיאלי עבור כל aptamers. כדי להשיג קיפול נכון של aptamer, מרכיבי חיץ assay ייתכן שיהיה צורך מחויטת, והמשיך קרוב ככל האפשר אל היצירה המשמשת חיץ מבחר aptamer. כאשר ניצול חיץ עם AuNPs, מרכיבי החיץ והריכוזיים חייבים להיחשב, במיוחד עם חומרים יוניים. ריכוזים גבוהים של תרכובות יוניות עלולים לגרום צבירה המוקדמת של AuNPs. כיסוי DNA / AuNP הודגם באיור 3. ככל DNAעליות כיסוי מ 90-180 DNA / AuNP, התגובה אנליטי היעד ירד גרימת רגישות assay מופחת. לכן, trade-off נדרש כי תלוי בכל aptamer, עקב קיפול ומידת אינטראקציות בפרט שלה עם המשטח AuNP.

בנוסף, ממסי צורך לפזר מולקולות אנליטי עלולים לגרום צבירה המכוונת של AuNPs. מים, חיץ assay, מתנול יש כל שימשו בלי בעיה. משומש ללא דילול, אצטוניטריל ו dimethylsulfoxide (DMSO) לספוג אל פני שטח AuNP גרימת צבירה בלתי צפויה. אצטוניטריל היה בעייתי אפילו דילולים של פחות מ -1% (נפח סופי). ממיסים צריך להיבדק עם AuNPs לפני השימוש עם assay colorimetric. הטמפרטורה שבה assay מבוצע יכול להשפיע על האם תגובה הוא ציין עם assay. זה קשור יותר לכך נעוצה במבנה aptamer ואת טמפרטורת ההתכה, או יציבות המבנה aptamer בטמפרטורה נתונה, מעם החלקיקים. בעבודתנו, קבענו כי קיים איזון עדין בין בעל aptamer במבנה לבמה להופיע עם DNA בצורה מקופלת, וגם לא לגמרי במבנה נטוש יחיד. זהו המקרה עבור הטופס assay aptamer adsorbed של מבחני colorimetric אלה (איור 1). כאשר בוחנים מבנה, רצף aptamer חייב גם להיות שקל בגלל הרבה של המבנה aptamer היא תוצאה של רצפים oligonucleotide הפרט. עם זאת, יש להוסיף ולחקור היבט זה נחוץ.

באופן כללי, הגישה אנו משתמשים בפיתוח assay colorimetric מבוסס aptamer-AuNP הוא זהה עבור כל זוגות aptamer / היעד. ראשית, לקבל aptamer עבור מטרה של עניין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות חיפוש בספרות או הבחירה של aptamer עבור מולקולה של עניין. בשלב זה, אין דרך לדעת אם aptamer הוא מועמד טוב ליצירת colorimetricassay. זה יכול להיקבע רק באמצעות התנסות. בשלב הבא, aptamer הוא מודגרות עם AuNPs לילה לפברק את assay aptamer adsorbed (איור 1). הגישה הסטנדרטית היא להתחיל לבדוק עם 60 aptamers / AuNP; עם זאת, כיסויים מרובים ערוכים לקראת השלב הבא של בדיקות. כאשר המבחנים מוכנים לבדיקה, לבצע חקירות העקומות טיטרציה כמתוארת (איור 2). נקודת האמצע של עקומת טיטרציה משמשת ריכוז מלח החל אמין לשמש היעד, ריק assay, ובדיקות שליטה. ריכוז המלח מכויל לספק הבדל צבע מרבי בין הדגימות הריקות יעד assay. כדי לבדוק את התגובה אמיתית שנגרם על ידי יעד aptamer מחייב ולא עקב אי היעד ספציפי / אינטראקציות ממסות, לבצע את assay עם פקדים. במקביל, זמני פיתוח צבע assay נחקרים ב 5 מרווחי דקות. ואחריו פעמי דגירת היעד-assay ב 5 דקות intervals, בתחילה 15+ פעמי דגירת דקות משמשות עד שלב זה הוא מותאם. בהתאם לתוצאות, אופטימיזציה נוספת של ריכוז המלח, כיסוי aptamer, זמן דגירה וזמן פיתוח צבע עשויה להיות נחוץ (איור 3). גישה זו מתארת ​​פרוטוקול בתכנון ופיתוח של מבחני colorimetric aptamer-AuNP עבור זוג היעד / aptamer. בדיקות נוספות לתוך רצף aptamer ואפקטים מבניים על השיפור של מבחני colorimetric aptamer adsorbed הן עניין רב. יש צורך בהבנת האינטראקציות קשורות aptamer, היעד, ואת AuNPs. ידע זה יכול להוביל תפירת aptamers עבור פונקציונליות טובה יותר ואפילו חיזוי אשר aptamers יהיה פעיל במתכונת assay aptamer adsorbed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
  2. Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
  3. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  4. Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
  5. Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
  6. Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
  7. Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  8. Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
  9. Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
  10. Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
  11. Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
  12. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  13. Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
  14. Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
  15. Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
  16. Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
  17. Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
  18. Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
  19. Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  20. Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  22. Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
  23. Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  24. Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
  25. Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 112 assay colorimetric ננו-חלקיקי זהב aptamer אפליקצית colorimetric חומצות גרעין ננוטכנולוגיה חיישנים ביולוגיים חיישנים אופטיים
עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, J. E., Chávez, J. L.,… More

Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter