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Biology

डिजाइन और Aptamer-सोने nanoparticle आधारित वर्णमिति assays के विकास में मैदान अनुप्रयोगों के लिए

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

डिजाइन और इन-द-क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए एक aptamer-सोने nanoparticle वर्णमिति परख के विकास जांच की गई थी। इसके अतिरिक्त, एक स्मार्ट डिवाइस वर्णमिति आवेदन (एपीपी) मान्य किया गया था और परख की लंबी अवधि के भंडारण के क्षेत्र में उपयोग के लिए स्थापित किया गया था।

Abstract

डिजाइन और एक aptamer-सोने nanoparticle (AuNP) में मैदान अनुप्रयोगों के लिए छोटे अणुओं का पता लगाने के लिए वर्णमिति परख के विकास जांच की गई थी। लक्ष्य चयनात्मक AuNP आधारित रंग assays नियंत्रित सबूत की अवधारणा प्रयोगशाला सेटिंग्स में विकसित किया गया है। हालांकि, इन योजनाओं की विफलता की एक बात करने के लिए लगाए गए नहीं किया गया है प्रयोगशाला सेटिंग से परे उनकी व्यावहारिक उपयोग निर्धारित करने के लिए। यह काम एक सामान्य दृष्टिकोण के डिजाइन, विकास, और समस्या निवारण के लिए छोटे अणु analytes और इन-द-क्षेत्र सेटिंग्स के लिए परख का उपयोग करने के लिए एक aptamer-AuNP वर्णमिति परख का वर्णन है। क्योंकि adsorbed aptamers passivate nanoparticle सतहों और कम करने और गैर लक्ष्य analytes के लिए झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को खत्म करने का एक साधन प्रदान परख फायदेमंद है। व्यावहारिक उपयोग करता है के लिए इस प्रणाली aptamer-AuNP परख की न केवल शैल्फ जीवन को परिभाषित करने की आवश्यकता संक्रमण है, लेकिन लंबी अवधि के भंडारण capabil विस्तार देने के लिए तरीकों और प्रक्रियाओं की स्थापनाities। इसके अलावा, वर्णमिति readout के साथ मान्यता प्राप्त चिंताओं में से एक बोझ विश्लेषकों पर रखा सही रंग में अक्सर सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान है। क्षेत्र में विश्लेषकों पर जिम्मेदारी को कम करने के लिए, एक रंग विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रयोगशाला ग्रेड उपकरण पर इस कार्य प्रदर्शन के लिए आवश्यकता के बिना रंग पहचान कर्तव्यों का पालन करने के लिए डिजाइन किया गया था। बनाने और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल के परीक्षण के लिए विधि वर्णित है। हालांकि समझते हैं और adsorbed aptamer assays के डिजाइन को प्रभावित करने के लिए, बातचीत aptamer, लक्ष्य के साथ जुड़े, और AuNPs आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। ज्ञान प्राप्त कार्यक्षमता में सुधार के लिए aptamers सिलाई करने के लिए ले जा सकता है।

Introduction

वर्णमिति विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में इस्तेमाल सबसे पुरानी तकनीकों में से एक है। इस तकनीक के लिए, analyte की एक गुणात्मक या मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक रंगीन यौगिक 1 के उत्पादन के आधार पर बनाई गई है। आमतौर पर, रंग assays अभिकर्मकों कि analyte प्रजातियों की उपस्थिति है, जो दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम में एक नमूदार या detectable रंग बदलने में परिणामों में एक रंग परिवर्तन का अनुभव का उपयोग करें। वर्णमिति ऐसे डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए), पेप्टाइड्स, और प्रोटीन के रूप में 2-4 परमाणुओं, आयनों, और जटिल जैविक अणुओं को छोटे अणुओं से लेकर लक्ष्य का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है। पिछले दो दशकों के लिए, विशेष रूप से रंग nanomaterials आधारित assays 5-6 के साथ पता लगाने assays के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। ऐसे एंटीबॉडी, oligonucleotide aptamers या पेप्टाइड aptamers के रूप में, एक लक्ष्य चयनात्मक मान्यता तत्व के साथ nanomaterials के अद्वितीय रासायनिक और भौतिक गुणों के संयोजन, पुनरुत्थान के लिए प्रेरित किया है मैंn डिजाइन और वर्णमिति पता लगाने assays 7 का विकास।

धातु नैनोकणों एक प्रदर्शन के आकार पर निर्भर रंग बदलने संपत्ति है, जो कई वर्णमिति assays के डिजाइन में शोषण किया गया है। सोने के नैनोकणों (AuNPs) एक विशिष्ट लाल करने वाली नीले रंग परिवर्तन, जब कणों की छितरी समाधान 8 कुल करने के लिए, आम तौर पर नमक की सटीक अलावा के माध्यम से प्रेरित किया जाता है के कारण विशेष रुचि के हैं। एकत्रित (नीला) राज्यों को तितर-बितर (लाल) से संक्रमण को नियंत्रित करने की क्षमता ईओण, छोटे आणविक, पेप्टाइड, प्रोटीन के लिए वर्णमिति सेंसर, और सेलुलर लक्ष्य 2-4,9 के निर्माण के लिए प्रेरित किया है। इन सेंसरों से कई लक्ष्य मान्यता आकृति के रूप में aptamers रोजगार।

Aptamers डीएनए या 10 से 12 -10 15 विभिन्न दृश्यों 10-11 के एक यादृच्छिक पूल से चयनित ribonucleic एसिड (आरएनए) अणु होते हैं। चयन प्रक्रिया के लक्ष्य फिर से पहचानतीकम nanomolar शासन में बाध्यकारी समानताएं साथ अनुभूति तत्वों, और घातीय संवर्धन (SELEX) द्वारा ligands के व्यवस्थित विकास सबसे अधिक जाना जाता प्रक्रिया 12-13 है। संवेदन अनुप्रयोगों के लिए oligonucleotide आधारित aptamers के लाभ चलाया रासायनिक संश्लेषण संशोधन की आसानी, और रासायनिक स्थिरता 14-15 शामिल हैं।

एक वर्णमिति परख बनाने के लिए एक दृष्टिकोण है, मान्यता तत्वों के साथ nanomaterials जोड़ती AuNP सतहों के लिए डीएनए aptamer अणुओं की शारीरिक सोखना के माध्यम से इन दो प्रजातियों के संयोजन के होते हैं। के माध्यम से लक्ष्य-aptamer बंधन, aptamer एक संरचनात्मक परिवर्तन 16-18 कि AuNP सतह है, जो नमक के अलावा के साथ एक inducible लाल करने वाली नीले रंग की प्रतिक्रिया 19 की ओर जाता है के साथ aptamer की बातचीत बदल अनुभव करता है। AuNPs की यह आश्चर्यजनक सुविधा aptamer आधारित उपकरणों है कि डे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक नमूदार वर्णमिति प्रतिक्रिया तंत्र प्रदान करता हैअलग analytes के लिए वर्णमिति assays करें।

रंग AuNP सतहों पर गैर सहसंयोजक, शारीरिक रूप से adsorbed डीएनए aptamers का उपयोग कर बनाया assays मजबूती, नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग्स के बाहर विफलता के लिए एक प्रवृत्ति है, और व्यावहारिक में उपयोग के लिए उपलब्ध जानकारी की कमी के साथ मुद्दों के कारण एक कमजोर सेंसर मंच होने का कलंक सेटिंग्स। हालांकि, aptamer-AuNP आधारित वर्णमिति परख संचालन और नमूदार रंग प्रतिक्रिया की सादगी की वजह से ब्याज की थी। इस काम के लक्ष्य के डिजाइन, विकास, संचालन, संबंधित सतह की कमी झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया, और लंबी अवधि के भंडारण डीएनए AuNP आधारित वर्णमिति प्रतिनिधि analyte के रूप में कोकीन का उपयोग कर assays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। इसके अलावा, हम सादगी और उपयोग में आसानी है कि इन aptamer-AuNP गधे के लिए परंपरागत दृष्टिकोण से कम चरणों में हुई होने के कारण लाभप्रद होने के रूप में इस adsorbed aptamer परख दृष्टिकोण (चित्रा 1) का प्रस्तावays। इस परख के लिए, aptamer पहले AuNPs है, जो समय की एक विस्तारित अवधि के लिए सतह को सोखना की अनुमति दी गई करने के लिए जोड़ा गया है। इस दृष्टिकोण के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह गैर लक्ष्य analyte AuNP सतह बातचीत से संबंधित अणुओं के जवाब की कमी थी। हालांकि, झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया में कमी परख संवेदनशीलता की कीमत पर किया गया था। इसलिए सतह के संरक्षण और analyte पहुंच के बीच एक संतुलन उचित परख समारोह को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, के माध्यम से रंग assays का विश्लेषण करने का एक प्रमुख दोष अन्य साधन के साथ तुलना इंस्ट्रूमेंटेशन है कि परिणाम अक्सर व्यक्तिपरक और से विश्लेषक करने वाली विश्लेषक व्याख्या के लिए खुले हैं, खासकर जब रंग में सूक्ष्म अंतर अंतर करने के लिए कोशिश कर रहा। इसके विपरीत, वहाँ इस तरह के आदि शक्ति की उपलब्धता, पोर्टेबिलिटी के साथ व्यावहारिकता, इस काम के रूप में, प्रयोगशाला के बाहर प्रयोगशाला आधारित इंस्ट्रूमेंटेशन प्रयोग करने योग्य बनाने के साथ मुद्दों का एक नंबर रहे हैं, एक रंग विश्लेषण प्रोटोकॉल mor के लिए विकसित किया गया थाई पोर्टेबिलिटी और आमतौर पर रंग आधारित परख व्याख्या 20-21 के साथ जुड़े अटकलबाजी से कुछ को खत्म करने के लिए। पिछले दृष्टिकोण की तुलना में, प्रयोगशाला सेटिंग्स परे अनुप्रयोगों के लिए अपनी सीमा को इन assays पुश करने के लिए इस प्रयास करते रहे।

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Protocol

1. सोने के नैनोकणों साइट्रेट कटौती (AuNP) और विशेषता के माध्यम से संश्लेषण

  1. 5 मिलीलीटर के साथ एक Erlenmeyer कुप्पी (500 मिलीलीटर) और बड़ी हलचल बार साफ नाइट्रिक एसिड केंद्रित है और 15 मिलीलीटर रासायनिक सुरक्षा हुड में हाइड्रोक्लोरिक एसिड ध्यान केंद्रित किया।
    1. एसिड धोने के साथ कुप्पी की पूरी सतह गीला, nuclease मुफ्त पानी के साथ फ्लास्क कुल्ला, और कुप्पी सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
  2. 1 मिमी सोना (तृतीय) क्लोराइड की 100 मिलीलीटर जोड़ें; एल्यूमीनियम पन्नी की एक चादर का उपयोग उबलते जब तक एक गर्म थाली पर एसिड साफ Erlenmeyer फ्लास्क और निरंतर क्रियाशीलता के साथ गर्मी के शीर्ष कवर करने के लिए।
  3. 38.8 मिमी सोडियम साइट्रेट के 10 मिलीलीटर जोड़ें। रंग कई मिनट से अधिक गहरे नीले / काले, और अंत में गहरे लाल रंग के लिए, स्पष्ट / ग्रे से बदल जाएगा। गर्मी के साथ 10 मिनट के लिए बंद सरगर्मी जारी है।
  4. AuNP निलंबन कमरे के तापमान को शांत और निरंतर सरगर्मी के साथ diethylpyrocarbonate (DEPC) के 110 μl जोड़ने के लिए अनुमति दें।
  5. साथ पूरे कुप्पी कवरएल्यूमीनियम पन्नी और DEPC उपचार रातोंरात सेते करने के लिए अनुमति देते हैं। अंधेरे में सभी AuNPs स्टोर, एम्बर भंडारण कंटेनर में या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया।
  6. AuNP निलंबन, कमरे के तापमान को शांत आटोक्लेव, और एक 0.22 माइक्रोन ताकना सेलूलोज एसीटेट झिल्ली के माध्यम से फिल्टर। फ़िल्टर, autoclaved AuNP शेयर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।
    नोट: DEPC के साथ उपचार, 4 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव के माध्यम से नसबंदी, और भंडारण aptamer-AuNP परख की शेल्फ जीवन में सुधार होगा। इस तरीके से भंडारण अधिक से अधिक 2 महीने के लिए कार्यात्मक रहने के लिए परख के लिए अनुमति देगा।
  7. 520 एनएम पर अल्ट्रा वायलेट-दृष्टिगोचर अवशोषण प्राप्त करने के द्वारा AuNP एकाग्रता की गणना, एकाग्रता और (ग) की गणना के द्वारा विलुप्त होने के गुणांक (ɛ) 2.4 x 10 8 एल मोल -1 सेमी -1 बीयर की विधि के साथ उपयोग करें। एकाग्रता गतिशील प्रकाश बिखरने द्वारा निर्धारित 15 एनएम के आकार के साथ 10 एनएम होने के लिए निर्धारित किया गया था।
    नोट: सांद्रता मंगलवार अलग अलग होंगेओम बैच को बैच। आवश्यक के रूप में nuclease मुफ्त पानी के साथ AuNP शेयरों पतला वांछित 10 एनएम AuNP निलंबन बनाए रखने के लिए।

2. डीएनए aptamer, बफर, समाधान, और परख तैयारी

  1. खरीद या मानक phosphoramidite रसायन विज्ञान का उपयोग कर 22 aptamer दृश्यों बाध्यकारी निम्नलिखित कोकीन synthesize:
    MN4 19: 5'-जीजीसी जीएसी आग GAA AAT सी सी टी टी सी ए ACG आग TGG जीटीसी जीसीसी -3 '
    MN6 19: 5'-जीएसी आग GAA AAT सी सी टी टी सी ए ATG आग TGG जीटीसी -3 '
  2. मानक desalting 23 का उपयोग कर aptamers शुद्ध। या तो 100 माइक्रोन या 1 मिमी स्टॉक समाधान पर nuclease मुक्त पानी में ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स Reconstitute। अशेष और कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. खरीद या बाँझ 1 एम 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) 7.4 पीएच के शेयरों तैयार, 100 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl), और 1 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl)।
  4. nuclease मुक्त पानी वाई में बफर के 50 मिलीलीटर की तैयारीमहीनों के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, 7.4 पीएच की सांद्रता वें और दुकान।
  5. कमरे के तापमान पर 3-4 घंटे के लिए शेयर AuNP समाधान (10 एनएम) के साथ डीएनए सेते हैं और प्रकाश से बचाने के। के रूप में पर्याप्त नमूना प्रदान करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए (2.5-7.5 एमएल) वांछित AuNPs की मात्रा बदलती हैं।
    1. इधर, इस काम में 90, 120, 150, और 180 डीएनए अणु / AuNP की लोडिंग घनत्व का उपयोग करें। मात्रा और उसके अनुसार डीएनए की सांद्रता बदलती हैं। ट्यून डीएनए गैर लक्ष्य analytes के अनपेक्षित AuNP सतह से संबंधित रंग प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए कवरेज।
      नोट: डीएनए कवरेज बढ़ाने से परख संवेदनशीलता कम हो जाएगा। लोड हो रहा है घनत्व AuNP शेयर की एकाग्रता को जानने, और मात्रा प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए वांछित में मौजूद AuNPs की कुल संख्या की गणना से गणना कर रहे हैं। वास्तविक कवरेज घनत्व वांछित हैं, प्रोटोकॉल उन मूल्यों 7 प्राप्त करने के लिए मौजूद हैं। डीएनए कवरेज एक 50 केडीए मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया थाolecular वजन कटऑफ स्पिन स्तंभ मुक्त डीएनए से AuNP बाध्य डीएनए अलग करने के लिए। AuNPs, स्पिन कॉलम के माध्यम से पारित करने के लिए बहुत बड़ी हैं, जबकि मुक्त डीएनए आसानी से गुजरना होगा। अगले कदम के लिए मुफ्त डीएनए absorbance के माप या एक भी असहाय डीएनए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर एकत्र यों की है।
  6. 20 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, 7.4 पीएच बफर के एक बराबर मात्रा जोड़ने और अंधेरे में रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें। Aptamer-AuNP परख एक 10 मिमी HEPES, 1 मिमी 2 MgCl, 7.4 पीएच (परख बफर) में था।

3. नमक अनुमापन और परख सेटअप

  1. प्रारंभिक नमक एकाग्रता परख खाली साथ नमक अनुमापन द्वारा परख रंग प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करने की जरूरत निर्धारित करते हैं। एक 96 अच्छी तरह से थाली में aptamer-AuNP परख के 180 μl aliquots को मेथनॉल (खाली) के 20 μl जोड़ें। शेयर सोडियम क्लोराइड समाधान (1 एम या 2 एम) की मात्रा में वृद्धि के साथ नमूने titrate और तुल्यता बिंदु निर्धारित (चित्रा 2 नोट: परख aptamer-AuNP परख ही को खाली मेथनॉल (या भंग analyte) के अनुपात रखकर छोटे संस्करणों के लिए बढ़ाया जा सकता है।
    1. इधर, सोडियम क्लोराइड की मात्रा दृश्य अवलोकन से थोड़ी सी भी रंग परिवर्तन का कारण करने की जरूरत का निर्धारण। परख के लिए शुरू एकाग्रता 75 मिमी और MN4 के लिए 130 मिमी और MN6 एक 60 डीएनए अणु / AuNP कवरेज घनत्व में क्रमश था।
      नोट: प्रारंभिक नमक एकाग्रता के लिए एक मात्रात्मक निर्धारण के लिए, अनुमापन वक्र के मध्य एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, इस्तेमाल किया सांद्रता aptamer, डीएनए कवरेज घनत्व, दिन-प्रतिदिन प्रदर्शन, और बैच को बैच से के आधार पर अलग अलग होंगे।
  2. परख प्रतिक्रिया का अनुकूलन, कमरे के तापमान पर एक 96 अच्छी तरह से थाली में aptamer-AuNP परख के 180 μl aliquots मेथनॉल में पतला analyte अणुओं के 20 μl जोड़ें। इसके तत्काल बाद पिछले चरण परख रंग प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए चुना गया NaCl एकाग्रता जोड़ें।
    नहींते: एक साथ कई प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग।
  3. बढ़ रही है या सोडियम क्लोराइड एकाग्रता कम है, और खाली जवाबी कार्रवाई के लिए लक्ष्य प्रतिक्रिया की तुलना द्वारा सबसे बड़ा रंग परिवर्तन संभव प्राप्त करते हैं। NaCl एकाग्रता है कि सबसे बड़ा अंतर प्रतिक्रिया प्रदान करता है का प्रयोग करें।
  4. का निरीक्षण करें या सोडियम क्लोराइड अलावा निम्नलिखित परख प्रतिक्रिया 150 सेकंड के उपाय। 650 एनएम और 530 एनएम पर absorbance एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग का विश्लेषण या परख प्रतिक्रिया (फोटो विश्लेषण प्रोटोकॉल के लिए धारा 4 देखें) की एक डिजिटल कैमरा फोटो प्राप्त करते हैं।
    ध्यान दें: एक microplate पाठक इस काम के लिए माप प्राप्त करने में इस्तेमाल किया गया था।
  5. 650 एनएम और 530 एनएम (ई 650 / ई 530) analyte एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्राप्त किया absorbance के अनुपात के रूप में परिणाम साजिश। के रूप में इस काम में किया गया था खाली संकेत करने के लिए परख प्रतिक्रिया मानक के अनुसार।

4. फोटो और डिजिटल छवि रंग विश्लेषण प्रोटोकॉल विश्लेषण

  1. preparई वर्णित (वर्गों 3.2-3.3) के रूप में परख नमूने हैं। एक transilluminator पर 96 अच्छी तरह से थाली रखें।
    ध्यान दें: एक मानक प्रयोगशाला transilluminator आम तौर पर इस विश्लेषण के लिए प्रयोग करने योग्य डिजिटल छवियों को प्राप्त करने के लिए बहुत उज्ज्वल है। ये transilluminators नियमित रूप से "अंधेरे लाइनों" स्थान दिया गया है कारण प्रकाश स्रोत की तीव्रता के कारण डिजिटल छवि में दिखाई देते हैं। एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) आधारित प्रकाश बॉक्स से एक transilluminator बनाना और अपारदर्शी प्लास्टिक का एक टुकड़ा अच्छी तरह से काम करता है।
  2. NaCl इसके बाद 150 सेकंड में 96 अच्छी तरह से थाली की तस्वीरें प्राप्त करते हैं, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवियों को आयात करते हैं, और औसत लाल, हरे और नीले रंग (आरजीबी) मूल्यों की गणना, एक वृद्धिशील औसतन तकनीक का उपयोग, के रूप में समीकरण 1 24 में दिखाया गया है:
    (1) 1 समीकरण
  3. , मानक आरजीबी (sRGB) रंग अंतरिक्ष से chromaticity आरेख (CIExyY) रंग अंतरिक्ष के लिए आरजीबी मूल्यों को बदलने निम्नलिखित समीकरण 24 का उपयोग करते हुए:
    (2) 2 समीकरण
    (3) 3 समीकरण
    (4) 4 समीकरण
  4. समीकरण 2. मैट्रिक्स समीकरण 3 में निर्दिष्ट का उपयोग कर रैखिक आरजीबी मूल्यों कन्वर्ट करने के लिए घातीय आरजीबी मूल्यों एक्स, वाई और सीआईई रंग अंतरिक्ष 24 के Z मूल्यों की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  5. समीकरण 4 का उपयोग कर विश्लेषण 24 के लिए चयनित क्षेत्र में पिक्सल के औसत रंग का प्रतिनिधित्व एक्स और वाई वार्णिकता मूल्यों की गणना।
  6. अच्छी तरह से हर में विश्लेषण करते हैं और वार्णिकता मूल्यों साजिश एक अंशांकन वक्र (चित्रा 4) उत्पन्न करने के लिए। एक ही अच्छी तरह के अलग-अलग क्षेत्रों के रंग का विश्लेषण करके मानक त्रुटि प्राप्त करते हैं।

5. लंबी अवधि के भंडारण के लिए Aptamer-AuNP परख बर्फ़ीली

  1. वर्गों 2.4 और 2.5 में वर्णित के रूप में aptamer-AuNP परख घटकों को तैयार। nuclease मुक्त पानी में 1 ग्राम / एमएल trehalose और 1 ग्राम / एमएल सूक्रोज युक्त cryogen समाधान बनाने के लिए अलग समाधान करते हैं।
    नोट: trehalose और सुक्रोज की उच्च सांद्रता जब ठंड के लिए परख तैयारी कमजोर पड़ने कारक कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया। पानी की एक बीकर में एक गर्म थाली पर चीनी समाधान गर्मी अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले शर्करा भंग करने के लिए।
  2. एक समाधान है कि 19.2 मिलीग्राम / एमएल trehalose और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 200 μl के अंतिम मात्रा में 4.8 मिलीग्राम 60 MN4 डीएनए / AuNP परख के साथ / एमएल सुक्रोज शामिल करें। अंतिम cryogen समाधान सांद्रता डीएनए कवरेज के साथ अलग अलग होंगे।
    नोट: नमूने जमा किया जा करने के लिए 300 μl अधिक नहीं होनी चाहिए। बड़ी मात्रा में ठीक से स्थिर नहीं हो सकती है।
  3. फ़्लैश एक -146 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर नमूने में फ्रीज। नमूने उपयोग करें जब तक जमे हुए स्टोर। भंडारण एक -80 डिग्री सेल्सियस में हो सकता है या -20 डिग्री एक बार फ्लैश सी ठंड पूरा हो गया है।
  4. इस काम के लिए, पर -146 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूने छोड़ देंरात और उसके बाद लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए स्थानांतरण।
    नोट: फ़्लैश ठंड aptamer-AuNPs कुल करने के लिए पैदा कर सकता है। absorbance प्रोफ़ाइल निगरानी और एक unfrozen नमूना करने के लिए तुलना करके जमने की प्रक्रिया की अखंडता का परीक्षण करें। एकत्रीकरण मनाया जाता है, इस मुद्दे के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए cryogen समाधान की मात्रा में वृद्धि।
  5. कमरे के तापमान पर नमूने गला लें और प्रयोग के लिए ही पर्याप्त नमूने के रूप में आवश्यक का उपयोग करें। thawed नमूनों की absorbance के स्पेक्ट्रा प्राप्त करें और एक unfrozen cryogen समाधान इलाज नमूना के आधारभूत स्पेक्ट्रा की तुलना करें। 400 एनएम से 700 एनएम absorbance के उपाय।
  6. , नमक अनुमापन (धारा 3.1) प्रदर्शन करना परख (धारा 3.2) का परीक्षण, और जैसा कि पहले से वर्णित परिणाम (वर्गों 3.3 और 3.4) साजिश है।

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Representative Results

इस काम के प्राथमिक उद्देश्य के लिए विकसित और स्थिरता और aptamer की मजबूती के क्षेत्र में उपयोग के लिए आधारित AuNP वर्णमिति assays जांच करने के लिए किया गया था। जैसा कि पिछले एक प्रकाशन में प्रकाश डाला, परख बनाने के लिए दो अलग-अलग रणनीतियों 7 जांच की गई। assays फ्री Aptamer परख और Adsorbed Aptamer परख करार दिया गया था। Adsorbed Aptamer परख एक fieldable पता लगाने परख (चित्रा 1) के प्रयोजनों के लिए और अधिक आकर्षक था।

आकृति 1
। चित्रा 1. Adsorbed Aptamer परख की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व aptamer AuNPs के साथ मिलाया और रात में incubated किया गया था; मेथनॉल में भंग analyte अणुओं अवशोषित Aptamer परख करने के लिए जोड़ा गया था, तुरंत AuNP एकत्रीकरण प्रेरित करने के लिए जब लक्ष्य जोड़ा गया है सोडियम क्लोराइड (NaCl) के अलावा द्वारा पीछा किया।एफई = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस nontarget analytes, रिश्तेदार सादगी, और Adsorbed Aptamer परख के उपयोग में आसानी के लिए झूठी सकारात्मक दरों में कमी की वजह से था। Adsorbed Aptamer परख तैयार करने के लिए, डीएनए aptamer AuNPs के साथ मिलाया और परख बफर में रात भर incubated था। इस aptamer आसानी से AuNP सतह है, जो इस तरह के मास्किंग या एजेंटों को काटने के रूप nontarget analyte अणुओं को झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया के लिए परख की संवेदनशीलता कम हो पर सोखना की अनुमति दी। हालांकि, केवल MN4 कोकीन aptamer की preformed संरचना इस परख डिजाइन में कोकीन (लक्ष्य) की उपस्थिति में सक्रिय था। परख analyte समाधान सोडियम क्लोराइड की उचित एकाग्रता के तत्काल अलावा द्वारा पीछा जोड़कर कार्यरत था। नमक समाधान नमूदार और विदेश मंत्रालय को आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया गयापरख के surable रंग बदल जाते हैं। परख 2-3 मिनट के भीतर मार डाला गया था। analyte समाधान के अलावा के बाद।

इन शारीरिक रूप से adsorbed डीएनए आधारित वर्णमिति assays के निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कार्रवाई प्रेरित रंग प्रतिक्रिया, नमक की उचित एकाग्रता के अलावा के माध्यम से होता है। लवण के अलावा साइट्रेट परत है कि AuNPs को स्थिर, और फिर interparticle electrostatic बातचीत घटता के नकारात्मक आरोप मास्किंग द्वारा कणों के एकत्रीकरण में जिसके परिणामस्वरूप AuNP निलंबन को अस्थिर करने के लिए जाना जाता है। परिणाम नमूदार लाल करने वाली नीले रंग बदल रहा है। एक ही प्रभाव डीएनए इलाज किया AuNPs के साथ मनाया जाता है। डीएनए aptamers के मामले में, विश्लेषक नमक आवश्यक की एकाग्रता का निर्धारण न्यूनतम नमूदार AuNP अस्थिरता (नीले रंग) पैदा करने के लिए। लक्ष्य के अलावा के साथ, डीएनए aptamer द्वारा AuNPs के स्थिरीकरण काफी एक obse में जिसके परिणामस्वरूप कम हो जाता हैrvable, औसत दर्जे का लक्ष्य खुराक प्रतिक्रिया रंग बदल जाते हैं। यह रंग परिवर्तन केवल नमक के उचित पूर्व निर्धारित राशि के अलावा के साथ माना जा सकता है।

समान रूप से महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जिसमें नमक के उचित एकाग्रता निर्धारित किया गया था। यह (चित्रा 2) परख कारतूस की एक श्रृंखला के लिए सोडियम क्लोराइड समाधान की बढ़ती सांद्रता जोड़कर एक अनुमापन वक्र प्रदर्शन से पूरा किया गया।

चित्र 2
चित्रा 2. नमक प्रेरित अनुमापन वक्र। साइट्रेट स्थिर (लाल), MN4 कोकीन बाध्यकारी aptamer (हरा), और MN6 कोकीन बाध्यकारी aptamer (बैंगनी) में इलाज AuNP नमूने सोडियम क्लोराइड (NaCl) के साथ titrated किया गया। नेत्रहीन प्राप्त प्रारंभिक नमक सांद्रता प्रत्येक अवस्था के लिए रंग का तीर इसी के साथ संकेत दिया गया था। त्रुटि सलाखों में मानक विचलन से परिभाषित कर रहे हैंमाप तीन प्रतियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इधर, प्रारंभिक नमक का इस्तेमाल किया एकाग्रता दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था, और नमक एकाग्रता है कि थोड़ी सी नीले रंग की रंगाई परख खाली साथ नमूदार वजह से होने के लिए लिया गया था। हालांकि एक और मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए, शोधकर्ताओं ने अनुसंधान के इस क्षेत्र के लिए नया एक शुरू नमक एकाग्रता के रूप में अनुमापन तुल्यता बिंदु के मध्य का उपयोग कर सकते हैं। इस बिंदु से आगे रंग प्रतिक्रिया तेजी से वृद्धि करने के लिए शुरू होता है। इसके अलावा, नमक परख के निष्पादन में इस्तेमाल एकाग्रता परख खाली और कोकीन प्रतिक्रियाओं के बीच रंग अंतर को अधिकतम करने के लिए समायोजित किया गया। यह बढ़ रही है और अनुमापन द्वारा निर्धारित राशि से नमक एकाग्रता कम से पूरा किया गया। नमक अनुमापन प्रक्रिया के लिए दैनिक प्रदर्शन किया गया थादिन-प्रतिदिन की परख के साथ परिवर्तनशीलता के लिए खाते। नमक परख के लिए आवश्यक एकाग्रता में बैच परिवर्तनशीलता कोई 20 से अधिक% थी। चित्रा 2 तीन अलग AuNP नमूने, साइट्रेट स्थिर (कोई डीएनए), MN4 (डीएनए aptamer स्थिर), और MN6 (डीएनए aptamer स्थिर) है। MN4 और MN6 नमूने के लिए डीएनए कवरेज 60 डीएनए अणु थे / AuNP, और प्रत्येक अनुमापन वक्र एक अलग अनुमापन तुल्यता बिंदु और मध्य सतह के उपचार द्वारा प्रदान की स्थिरता के स्तर के आधार पर किया है। साइट्रेट थोड़ा स्थिरता, MN4 (संरचना की तरह डबल असहाय) प्रदान की और अधिक स्थिरता और MN6 (संरचना की तरह एकल असहाय) प्रदान की AuNPs के लिए सबसे अधिक स्थिरता प्रदान की है। प्रारंभिक नमक इस काम में इस्तेमाल सांद्रता होने की ~ 50 मिमी, ~ 90 मिमी, और ~ 130 मिमी नेत्रहीन निर्धारित किया गया है। प्रवृत्ति डीएनए संरचना की पारंपरिक समझ और AuNPs 24-25 पर इसकी स्थिर प्रभाव के साथ सहमत हैं। जब नेत्रहीन इस परीक्षा में प्रदर्शन, परख खाली एक मामूली नीले Colora दिखाया जो के रूप में चर्चा midpoints के करीब हैं नमक सांद्रता तीर के साथ चित्रा 2 में पहचान के रूप में, के साथ tion। शोध करे अंक से पहले नमक सांद्रता कम या कोई नमूदार रंग बदलने प्रदान करते हैं और इन बातों से परे रंग बढ़ जाती है तेजी से। इस काम के लिए, प्रारंभिक नमक एकाग्रता नेत्रहीन निर्धारित किया गया था और उसके बाद परख खाली और कोकीन के नमूनों की microplate रीडर माप तुलना का उपयोग ठीक-देखते।

फ्री Aptamer परख दृष्टिकोण के साथ, झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाएं एक मुद्दे थे। Analyte अणुओं की सतह बातचीत पिछले एक प्रकाशन 7 में वर्णित है, इस मुद्दे के लिए एक स्रोत हैं। अविशिष्ट AuNP सतह संबंधों के कारण अनजाने में रंग प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, लक्ष्य बाध्यकारी aptamer के डीएनए कवरेज घनत्व (चित्रा 3) नियंत्रित किया गया था।

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अलग-अलग डीएनए कवरेज घनत्व के साथ चित्रा 3. Adsorbed aptamer परख प्रतिक्रिया। कोकीन के एकत्रीकरण प्रतिक्रिया (लाल, लक्ष्य), ईएमई (हरे, नियंत्रण), और procaine (नीला), एक AuNP सतह सक्रिय अणु, 90 के लिए, 120, 150, और 180 डीएनए / AuNP कवरेज घनत्व प्रदर्शित किए गए। सभी नमूनों का विश्लेषण किया 1 मिलीग्राम / एमएल में मेथनॉल में भंग कर रहे थे। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप में मानक विचलन से परिभाषित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामान्य तौर पर, AuNP संबंधों के कारण nontarget analyte अणुओं की झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया की दर डीएनए कवरेज घनत्व में वृद्धि के साथ कम हो गया था। हालांकि, परख संवेदनशीलता बढ़ डीएनए कवरेज का एक परिणाम के रूप में कम हो गया था। इस काम में, 60, 90, 120, 150, 180, और 300 डीएनए / AuNP investiga थे के डीएनए घनत्वटेड। 60 और 300 के घनत्व में बड़े पैमाने पर पिछले काम 7 में वर्णित किया गया। चित्रा 3 अध्ययन अतिरिक्त डीएनए घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है। Procaine सर्वेक्षण में अधिक उच्च सतह सक्रिय nontarget analytes में से एक था। व्यक्तिगत डीएनए कवरेज से प्रत्येक के लिए, परख प्रतिक्रिया के रूप में वर्णित नमक एकाग्रता का समायोजन करके maximized था। डीएनए कवरेज वृद्धि के रूप में सामान्य में, नियंत्रण (ईएमई) और कोकीन प्रतिक्रिया के बीच प्रतिक्रिया अंतर कम हो जाती है। इसी तरह, procaine की उपस्थिति में परख प्रतिक्रिया बढ़ती जा रही कवरेज के साथ पृष्ठभूमि स्तर तक कम हो जाती है। 180 डीएनए / AuNP घनत्व का सफाया सतह से संबंधित procaine के लिए झूठी सकारात्मक प्रतिक्रिया, जबकि एक उच्च लक्ष्य प्रतिक्रिया बनाए रखना है। यह आकलन, सतह से संबंधित झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए इन रंग assays ट्यूनिंग जबकि जितना संभव हो उतना लक्ष्य प्रतिक्रिया के संरक्षण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। सुधार संवेदनशीलता डीएनए कवरेज की कमी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, झूठी posiसक्रिय प्रतिक्रियाओं आवेदन के आधार पर एक मुद्दा बन सकता है।

वर्णमिति assays आमतौर पर त्वरित, सरल अक्सर प्रकल्पित गुणात्मक और मात्रात्मक भी परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। वर्णमिति निर्धारण के साथ आम मुद्दों, रंग प्रभेद के व्यक्तिपरक प्रकृति के हैं विशेष रूप से सूक्ष्म और सीमा रेखा रंग मतभेदों के साथ। निर्णय कॉल जो विश्लेषक द्वारा किया जाना चाहिए डेटा की गलत व्याख्या हो सकती है। प्रयोगशाला उपकरणों पर माप अनिश्चितता और परख परिणामों का आकलन करने के साथ जुड़े अनिर्णय कम। हालांकि इस काम में, आशय एक क्षेत्र के लिए तैयार परख है कि विश्लेषक के लिए तत्काल परिणामों प्रदान की उपलब्ध कराने के लिए किया गया था। जैसे, एक फोटो छवि विश्लेषण तकनीक स्थापित किया गया था कि एक अधिक निर्णायक रंग परिणाम (चित्रा 4) प्रदान की है।

चित्रा 4
चित्रा 4। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोकीन की सांद्रता में वृद्धि के साथ, परख रंग एक बढ़ती हुई नीले रंग में हुई। अंशांकन घटता का डिजिटल फोटो दो अलग smartphones का उपयोग कर प्राप्त, और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक मानक लैपटॉप कंप्यूटर के लिए आयात किया गया। वार्णिकता मूल्यों सी साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया गयाके रूप में alibration घटता 4 चित्र में दिखाया गया है। छवि विश्लेषण स्मार्टफोन छवियों के दोनों सेट के रूप में आर 2 मूल्यों ने संकेत के साथ कोकीन एकाग्रता बढ़ाने के लिए एक रेखीय प्रतिक्रिया प्रदान की है। इस पद्धति का एक स्मार्ट डिवाइस app करने के लिए संक्रमित कर दिया गया था क्षेत्र में विश्लेषक सहायता करने के लिए। एप्लिकेशन का एक विस्तृत मूल्यांकन पिछले एक प्रकाशन 7 में प्रदर्शन किया गया था। एप्लिकेशन अनिश्चितता और सबसे कम कोकीन सांद्रता के सूक्ष्म रंग बदलने के परिणामों के साथ जुड़े अनिर्णय की ज्यादा सफाया कर दिया।

इस प्रकार के शारीरिक रूप से adsorbed डीएनए परीक्षणों की लंबी अवधि के भंडारण महान विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है और इस काम के लक्ष्यों में से एक परख शेल्फ जीवन का विस्तार करने के लिए की स्थिति पता लगाने के लिए किया गया था। 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए परख घटकों के उपचार में पिछले एक प्रकाशन 6 में वर्णित किया गया था। इस काम के लिए, तैयार परख घटकों के lyophilization लंबी अवधि के उपयोग और भंडारण ओ के लिए माना जाता थापरख च। परख घटकों Lyophilizing रखने और परिवेश के तापमान पर नमूने, जो एक फ्रिज या फ्रीजर के लिए आवश्यकता को समाप्त होगा संचय के लिए विशिष्ट लाभ है। lyophilizing प्रक्रिया में प्राथमिक कदम पहला नमूना फ्रीज करने के लिए है। AuNP नमूने जमने की प्रक्रिया के जीवित रहने की जांच करने के लिए, पहले thawed नमूना की है कि ठंड के परख के absorbance स्पेक्ट्रा की तुलना करते हैं। स्कैन बिल्कुल मेल खाना चाहिए। नमूने जमने की प्रक्रिया से बच नहीं पा रहे हैं तो, thawed नमूना स्पेक्ट्रम 525 एनएम ऊपर क्षेत्र में absorbance बढ़ जाएगी। यह इंगित करता है कि AuNPs ठंड के दौरान एकत्रित और thawed नमूना समझौता किया है। Thawed परख की व्यवहार्यता कोकीन और ईएमई (चित्रा 5) के साथ परीक्षण किया गया था।

चित्रा 5
चित्रा 5. Adsorbed Aptamer परख प्रतिक्रिया शैल्फ जीवन का अध्ययन। Quantificaके tion ईएमई (हरे, नियंत्रण), और कोकीन (लाल, लक्ष्य) के लिए परख प्रतिक्रिया जमे हुए के साथ प्रदर्शन किया और फिर चार सप्ताह की अवधि के दौरान Adsorbed Aptamer परख नमूने thawed। त्रुटि सलाखों तीन प्रतियों माप में मानक विचलन से परिभाषित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

thawed परख खाली नमूने नमूने के रूप में अध्ययन की अवधि में एक ही मूल्य है कि बना दिया है और इस्तेमाल किया गया तुरंत (कोई भंडारण) पर बने रहे। कोकीन और ईएमई नमूनों की प्रतिक्रियाएं बनाया और तुरंत इस्तेमाल नमूने (कोई भंडारण) के साथ मनाया ठेठ प्रतिक्रियाओं के साथ संगत कर रहे थे। समय 7 की इसी अवधि में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों या करने के लिए परख नमूने बनाया और immediatel इस्तेमाल की तुलना के रूप में जमे हुए नमूने परख प्रदर्शन करने के लिए कोई परिवर्तन के साथ 4 सप्ताह की अवधि के लिए निगरानी की गईवाई। कोकीन प्रतिक्रियाओं 4 सप्ताह की अवधि, जो भी 4 डिग्री सेल्सियस के नमूने 7 के लिए मनाया गया दौरान अपेक्षाकृत स्थिर थे। सप्ताह 2 सप्ताह के लिए 1 से ईएमई संकेत में कमी अक्सर के रूप में अच्छी तरह से कमरे के तापमान और 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण के साथ मनाया जाता है। एक घटना हम पहले सप्ताह के दौरान परख की परिपक्वता के लिए जिम्मेदार ठहराया। यह दृष्टिकोण विकल्प adsorbed डीएनए वर्णमिति assays के लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपलब्ध संवर्धित, और अतिरिक्त लंबी अवधि के भंडारण विकल्प, अर्थात् lyophilization लिए एक प्रवेश द्वार प्रदान की है।

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Discussion

पिछले दशक के दौरान, nanoparticle आधारित वर्णमिति assays के लक्ष्य का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है छोटे अणुओं, डीएनए, प्रोटीन, और कोशिकाओं 2-4 शामिल हैं। Assays कि नैनोकणों के साथ उपयोग डीएनए aptamers ब्याज प्राप्त किया गया है। आमतौर पर, इन वर्णमिति assays AuNPs 9-10 के अलावा द्वारा पीछा किया analyte अणुओं के साथ डीएनए aptamer मिश्रण से प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इन assays नियंत्रित प्रयोगशाला सेटिंग्स के साथ सबूत की अवधारणा प्रदर्शनों में और सीमित, चयनित नियंत्रण के साथ उपयोग किया गया है। हाल की प्रगति संक्रमण के क्षेत्र में इस तकनीक 7 बनाया गया है। इस दृष्टिकोण में, डीएनए aptamer AuNP को adsorbed था सतहों analyte अणुओं के अलावा पहले परीक्षण किया जा करने के लिए (चित्रा 1)। या तो aptamer-सोने nanoparticle आधारित वर्णमिति assays के विकास के निर्माण / विश्लेषण की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में अनुकूलन की आवश्यकता है। इस प्रकार, डिस्क को उन नएipline शोधन और इन assays के निवारण के सफल होने के लिए के साथ जुड़े बारीकियों के बारे में पता होना चाहिए।

adsorbed aptamer-सोने nanoparticle assays के प्रत्येक aptamer / लक्ष्य जोड़ी के लिए सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है। हालांकि, निम्नलिखित कदम यहाँ समझाया इन वर्णमिति assays के अनुकूलन प्रदर्शन के लिए एक सुसंगत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। दृढ़ संकल्प और नमक एकाग्रता है कि लक्ष्य और परख खाली बीच अधिकतम नमूदार या औसत दर्जे का रंग बदलने में जो परिणाम के समायोजन और अधिक महत्वपूर्ण अनुकूलन कदम (आंकड़े 2 और 3) में से एक है। कुछ aptamer / लक्ष्य जोड़े के लिए, हमने देखा है कि अनुमापन वक्र के अंत बिंदु के पास उच्च नमक सांद्रता का उपयोग कर एक नीले रंग के लिए लाल रंग पारी 18 में हुई है। यह लक्ष्य और नमक के अलावा पर aptamer द्वारा AuNPs का एक स्थिरीकरण इंगित करता है।

अन्य कारकों है कि परख पे प्रभावित हो सकता हैrformance बफर घटकों और सांद्रता, डीएनए aptamer कवरेज की राशि का इस्तेमाल किया, सॉल्वैंट्स, तापमान, aptamer अनुक्रम और संरचना, लक्ष्य-परख ऊष्मायन समय (समय जब लक्ष्य परख करने के लिए जोड़ा जाता है, नमक अलावा पहले), और रंग विकास के समय में शामिल हैं ( समय रंग को विकसित करने के लिए आवश्यक है, नमक इसके बाद)। एक 10 मिमी HEPES, 1 मिमी 2 MgCl 7.4 पीएच बफर हमारे काम में इस्तेमाल लक्ष्य / aptamer जोड़े में से कई में पसंद की परख बफर था। हालांकि, इस बफर सभी aptamers के लिए आदर्श नहीं हो सकता है। aptamer की उचित तह प्राप्त करने के लिए, परख बफर घटकों अनुरूप होना चाहिए, और aptamer चयन बफर में इस्तेमाल रचना करने के लिए संभव के रूप में बंद रखा जा सकता है। जब AuNPs के साथ एक बफर का उपयोग, बफर घटकों और सांद्रता, विशेष रूप से विचार किया जाना चाहिए आयनिक पदार्थ के साथ। आयनिक यौगिकों की उच्च सांद्रता AuNPs के समय से पहले एकत्रीकरण का कारण बन सकता है। डीएनए / AuNP कवरेज चित्रा 3 में प्रदर्शन किया गया। डीएनए के रूप में90-180 डीएनए / AuNP से कवरेज बढ़ जाती है, लक्ष्य analyte प्रतिक्रिया को कम परख संवेदनशीलता के कारण कमी आई है। इसलिए, एक व्यापार बंद की जरूरत है कि अपनी विशेष तह और AuNP सतह के साथ बातचीत की डिग्री की वजह से, प्रत्येक aptamer पर निर्भर करता है।

इसके अतिरिक्त, analyte अणुओं को भंग करने की जरूरत सॉल्वैंट्स AuNPs के अनपेक्षित एकत्रीकरण में हो सकता है। जल, परख बफर, और मेथनॉल सभी मुद्दे के बिना इस्तेमाल किया गया है। कमजोर पड़ने, acetonitrile और dimethylsulfoxide के बिना इस्तेमाल किया (DMSO) AuNP सतह अनायास ही एकत्रीकरण के कारण सोखना। Acetonitrile भी कम से कम 1% (अंतिम मात्रा) के dilutions पर समस्याग्रस्त किया गया था। सॉल्वैंट्स वर्णमिति परख के साथ उपयोग करने से पहले AuNPs के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए। तापमान जिस पर परख प्रदर्शन किया है एक प्रतिक्रिया परख के साथ मनाया जाता है, इस पर एक प्रभाव हो सकता है। यह एक निश्चित तापमान पर aptamer संरचना और तापमान के पिघलने, या aptamer संरचना की स्थिरता के साथ नहीं करना है, की तुलना में हैनैनोकणों के साथ। हमारे काम में, हम निर्धारित किया है एक जोड़ रूप में डीएनए के साथ एक preformed संरचना में aptamer होने के बीच एक नाजुक संतुलन है कि वहाँ, और यह भी एक भी फंसे संरचना में पूरी तरह से नहीं। यह (चित्रा 1) इन वर्णमिति assays के adsorbed aptamer परख फार्म के लिए मामला है। जब संरचना पर विचार कर, aptamer अनुक्रम भी विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि aptamer संरचना के बहुत व्यक्तिगत oligonucleotide दृश्यों का परिणाम है। हालांकि, इस पहलू में आगे की जांच की जरूरत है।

सामान्य तौर पर, हम एक दृष्टिकोण aptamer-AuNP आधारित वर्णमिति परख के विकास में उपयोग सभी aptamer / लक्ष्य जोड़े के लिए ही है। सबसे पहले, ब्याज की एक लक्ष्य के लिए एक aptamer प्राप्त करते हैं। यह साहित्य या ब्याज की एक अणु के लिए एक aptamer के चयन खोज के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। इस स्तर पर, वहाँ जानने का कोई तरीका aptamer एक वर्णमिति बनाने के लिए एक अच्छे उम्मीदवार है कि क्या हैपरख। यह केवल प्रयोग के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। अगले, aptamer adsorbed aptamer परख (चित्रा 1) के निर्माण के लिए रात भर AuNPs साथ incubated है। मानक दृष्टिकोण 60 aptamers / AuNP के साथ परीक्षण शुरू करने के लिए है; हालांकि, कई कवरेज परीक्षण के अगले चरण के लिए तैयार हैं। जब assays के परीक्षण के लिए तैयार कर रहे हैं, वर्णित (चित्रा 2) के रूप में अनुमापन वक्र जांच करते हैं। अनुमापन वक्र के मध्य एक विश्वसनीय शुरू नमक एकाग्रता लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, परख खाली, और नियंत्रण परीक्षण के रूप में कार्य करता है। नमक एकाग्रता लक्ष्य और परख खाली नमूनों के बीच एक अधिकतम रंग अंतर प्रदान करने के लिए ठीक-देखते है। प्रतिक्रिया वास्तविक और aptamer लक्ष्य बाध्यकारी की वजह से और गैर विशिष्ट लक्ष्य / विलायक संबंधों के कारण नहीं है का परीक्षण करने के लिए, नियंत्रण के साथ परख करते हैं। इसके साथ ही, परख रंग विकास बार 5 मिनट के अंतराल पर जांच कर रहे हैं। 5 मिनट inte पर लक्ष्य-परख ऊष्मायन बार द्वारा पीछाrvals, शुरू में 15 मिनट ऊष्मायन बार जब तक इस कदम अनुकूलित है उपयोग किया जाता है। परिणामों पर निर्भर करता है, नमक एकाग्रता, aptamer कवरेज, ऊष्मायन समय और रंग विकास के समय के आगे अनुकूलन के लिए आवश्यक (चित्रा 3) हो सकता है। यह दृष्टिकोण डिजाइन और aptamer-AuNP वर्णमिति assays के विकास के लिए एक लक्ष्य / aptamer जोड़ी के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। aptamer अनुक्रम और adsorbed aptamer वर्णमिति assays के सुधार पर संरचनात्मक प्रभाव में आगे की जांच बहुत रुचि के हैं। aptamer, लक्ष्य, और AuNPs के साथ जुड़े बातचीत को समझने के लिए एक की जरूरत नहीं है। यह ज्ञान बेहतर कार्यक्षमता के लिए aptamers सिलाई और यहां तक ​​की भविष्यवाणी जो aptamers adsorbed aptamer परख प्रारूप में सक्रिय हो जाएगा करने के लिए ले जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

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References

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जैव रसायन अंक 112 वर्णमिति परख सोने के नैनोकणों aptamer वर्णमिति एप्लिकेशन न्यूक्लिक एसिड नैनो biosensors ऑप्टिकल सेंसर
डिजाइन और Aptamer-सोने nanoparticle आधारित वर्णमिति assays के विकास में मैदान अनुप्रयोगों के लिए
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Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

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