Three-Dimensional Culture Assay pour explorer des cellules cancéreuses invasives et Tumor Satellite Formation

Summary

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Abstract

culture de cellules animales dans des monocouches est largement utilisé pour étudier divers processus physiologiques et moléculaires. Cependant, cette approche pour étudier les cellules en croissance génère souvent des artefacts indésirables. Par conséquent, la culture de cellules dans un (3D) de l' environnement en trois dimensions, souvent en utilisant des composants de la matrice extracellulaire, est apparue comme une alternative intéressante en raison de sa similitude avec le natif dans un tissu ou un organe in vivo. Nous avons développé un système de culture cellulaire 3D à l' aide de deux compartiments, à savoir : (i) un compartiment central contenant des cellules cancéreuses noyées dans une faisant office de gel de collagène comme une tumeur macrospherical pseudo-primaire et (ii) un compartiment acellulaire périphérique constituée d'un gel de fibrine, soit un composant de la matrice extracellulaire différent de celui utilisé dans le centre, dans lequel les cellules cancéreuses peuvent migrer (invasion avant) et / ou de former des tumeurs microsphériques qui représentent les tumeurs secondaires ou satellites. La formation de tumeurs par satellite dans le compartiment périphérique estremarquablement en corrélation avec l'agressivité connue ou d'origine métastatique des cellules tumorales d'origine, ce qui rend ce système de culture 3D unique. Cette méthode de culture des cellules peut être considérée pour évaluer le cancer invasif et de la motilité des cellules, les interactions cellule-matrice extracellulaire et une méthode pour évaluer les propriétés des médicaments anti-cancéreux.

Introduction

L' étude des caractéristiques fondamentales et biomédicales de l' invasion des cellules cancéreuses / migration et l' établissement de métastases ultérieures est l'objet d'un ^1,2 de recherche intense. Métastase est le stade ultime du cancer et de sa prise en charge clinique reste insaisissable. Une meilleure compréhension des métastases aux niveaux cellulaires et moléculaires permettra le développement de thérapies plus efficaces ^3.

Plusieurs propriétés des cellules métastatiques peuvent être explorées ⁴ in vitro , y compris leur stemness et le potentiel d'acquérir un état ​​de transition (par exemple, la transition épithélio-mésenchymateuse) à migrer et à envahir et à l'intérieur de la tumeur primaire ^5. Toutefois, l'évaluation in vitro de processus / de métastases d'invasion a été un défi , car il exclut pratiquement la contribution du sang / circulation lymphatique. cultures organotypiques qui intègrent des fragments de tumeur dans des gels de collagène ont Previously été utilisé pour surveiller l'agressivité du cancer. Bien que la complexité des tumeurs est conservée (par exemple, la présence de cellules non cancéreuses), des fragments de tumeur sont exposées à une diffusion moyenne limitée à une variation d'échantillonnage et à une prolifération de cellules stromales ^6. Une méthode alternative consiste dans les cellules cancéreuses en croissance au sein des composants de la matrice extracellulaire (ECM), qui imite la (3D) de l'environnement de la cellule à trois dimensions. La prolifération des lignées de cellules de cancer du sein dans un gel de collagène et / ou une matrice de membrane basale dérivé est parmi les exemples les mieux caractérisés de la culture de cellules 3D. En utilisant des milieux de culture cellulaire 3D spécifiques, l'ensemble désorganisé observée pour les cellules cancéreuses du sein cultivées dans des conditions standard peut être inversé pour la formation spontanée d'acini mammaires et des structures tubulaires ^7-10. En outre, la formation de sphéroïdes de tumeur multicellulaires dérivées de cellules cancéreuses d'adénocarcinome rassemblés en utilisant différentes techniques (par exemple, la pendaison gouttes, sphéroïdes flottante, agar embedment) constitue désormais la cellule 3D culture test le plus couramment utilisé ^11-13. Cependant, cet essai est limité par l'ensemble limité de lignées cellulaires cancéreuses qui peuvent former des sphéroïdes et par la courte période disponible pour étudier les cellules dans ces conditions.

Dans cette technique visualisée, nous ici introduire un dosage de culture cellulaire 3D sophistiqué où les cellules cancéreuses d'intérêt sont incorporés dans un gel de collagène pour permettre la formation in vitro d'une tumeur pseudo-primaire qui peut être alternativement revêtue d'une membrane – matrice dérivée de sous – sol. Une fois formée, la tumeur pseudo-primaire est alors prise en sandwich dans une matrice acellulaire (gel de fibrine dans le cas présent), ce qui permet aux cellules cancéreuses de traverser l'interface entre les deux compartiments de la matrice (voir figure 1). Fait intéressant, des structures ressemblant à des tumeurs secondaires issues de la tumeur pseudo-primaire ainsi que des cellules cancéreuses agressives apparaissent dans leun gel de fibrine. Un tel système de culture 3D offre la flexibilité nécessaire pour enquêter sur , par exemple, les médicaments anticancéreux, expression génique et cellule-cellule et / ou les interactions cellule-ECM ^14-16.

Figure 1:.. Vue d' ensemble de la méthode résumé schématique de la méthode pour générer le système de culture cellulaire 3D comme un modèle pour les études sur le cancer S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

NOTE: Aucune éthique considération car les cellules animales et les cancers humains ont été achetés ou aimablement fournis pour nous. 1. Faire de collagène Plugs (pseudo-tumeur primaire) Préparer une dispersion de collagène. Collagène de type I de tendons de queue de rat (RTT) peuvent être soit extraits et stérilisés comme indiqué précédemment 17, ou achetés. Disperser lyophilisé RTT collagène (3,25 à 3,50 mg / ml dans 0,02 N d'acide acétique) en utilisant un mélang…

Representative Results

Comme mentionné précédemment, une caractéristique intéressante de ce test de culture de cellules 3D est que les cellules cancéreuses ne peuvent pas migrer uniquement du bouchon de collagène dans le gel de fibrine adjacente, mais aussi d' établir des tumeurs secondaires (structures , par exemple, le satellite tumeurs similaires). Ceci peut être observé directement avec un microscope à contraste de phase inversée à des grossissements faibles et élevées à traver…

Discussion

Comme une note technique important, il est essentiel qu'aucun écart est présent à l'interface entre la centrale et les gels périphériques. Dans le cas contraire, il pourrait réduire la capacité des cellules à migrer / envahissent le gel de fibrine. Un espace entre le collagène et les gels de fibrine peuvent se former pendant les 24 premières heures de la culture si la thrombine n'a pas été dilué de manière appropriée. Il est également possible que la lignée cellulaire testée pourrait entra?…

Materials

Freeze-dried collagen	Sigma-Aldrich	C7661	from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogen (freeze-dried)	Sigma-Aldrich	F8630	Type I-S, 65-85% protein with ≥75% of protein is clottable
Thrombin	EMD Chemicals Inc.	605157	Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356234	Previously from BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	solution at 5-10TIU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)
Micro-spoons	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96 well plate, round base	Sarstedt	3925500
24 well plate	Sarstedt	3922
Dulbecco's modified Eagle's Medium	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
Fetal Bovine Serum	VWR	CAA15-701	FBS, Canadian origin.
Trypsin-EDTA	Sigma Chemical, Co.	T4049
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Chemical, Co.	H8264	HBSS